1 / 19

Osnova

3.Přednáška Buněčný cyklus Párování haploidních buněk Regulace transkripce Přepínání párovacího typu 4.Přednáška Regulace transkripce Promotory Transkripční faktory Gal4p Hybridní systémy. Osnova.

ovid
Download Presentation

Osnova

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 3.Přednáška Buněčný cyklus Párování haploidních buněk Regulace transkripce Přepínání párovacího typu 4.Přednáška Regulace transkripce Promotory Transkripční faktory Gal4p Hybridní systémy Osnova

  2. vnitřní metabolismus např. transkripce genů důležitých pro jednotlivé fáze buněčného cyklu • signální dráhy regulují transkripci specifických „genových souborů“ (aktivace haploid specifických genů) • reakce na vnější vlivy např. využití galaktózy jako zdroje uhlíku v nepřítomnosti glukózy (historicky + GAL1 promotor je velmi silný) Regulace transkripce MAT lokus Typ buňky Geny kontrolované MAT lokusem aSG ON aSG OFF haploid SG ON a1, a2 a haploid a2 aSG OFF aSG ON haploid SG ON a1, a2 a haploid a1 a2 aSG OFF aSG OFF haploid SG OFF a1, a2 a1, a2 diploid a1 a1 a2

  3. Represor na URS Aktivátor na UAS konstitutivní • Kvasinkové promotory se liší od bakteriálních a vyšších eukaryot (kvasinky netranskribují z takových promotorů) • Většina míst pro iniciaci transkripce obsahuje TC(G/A)A a PuPuPyPuPu (specifické pro kvasinky) • TATA box (TATAT/AAT/A) je 60-120bp od iniciačního místa (podobné Pribnowovu boxu u bakterii) • UAS (upstream activating sequences) a URS (upstream repressing sequences) • DAS (downstream activating sequences – přímo v sekvenci genu) Struktura promotorů a2 aSG OFF aSG ON haploid SG ON a1, a2 a haploid a1

  4. Fosfoglycerat kinasa (PGK) 20x indukován glukózou Galaktokinasa (GAL1) 1000x indukován galaktózou, ale reprimován glukózou Kyselá fosfatasa (PHOS) 200x reprimován anorg. fosfátem Alkohol dehydrogenasa I (ADH1) konstitutivní Alkohol dehydrogenasa II (ADH2) 100x reprimován glukozou Cu metalothionein (CUP1) 20x indukován mědí Metionin (MET1) reprimován metioninem

  5. Regulace metabolické dráhy galaktózy • Pouze GAL5 gen je konstitutivně exprimován (potřebný pro metabolismus glukózy) • všechny ostatní jsou indukovány růstem na galaktóze a reprimovány glukozou • GAL1, GAL7 a GAL10 geny jsou v klastru na chromosomu 2 • GAL4 gen kóduje transkripční faktor (aktivátor), který se váže na UAS těchto genů • Gal80p se váže na Gal4p a reprimuje/inhibuje transkripci • Gal3p přemění galaktozu na induktor (váže se na Gal80p a blokuje vazbu na Gal4p) • GAL1 promotor je rychle indukovaný a velmi silný – 1000x se zvýší mRNA (až 1%) • používá se pro overexprese

  6. Transkripční aktivátor Gal4p Transkripční komplex CO Biotech (1995) p. 59

  7. Vznik 1- a 2-hybridních systémů Y-DB AD transkripce CGGATCCC (UAS) minimální Reporter gen - Takto funguje např. i FASAY (Functional Analysis of Separated Alleles in Yeast) pro testování mutantních p53 (transkripční faktor) AD Y X DBD transkripce GAL1 UAS minimální Reporter gen Stanley Fields, Nature (1989) p. 245

  8. MaV203 kmen navíc obsahuje URA3 reporter gen – lze tedy selektovat na uracilovou auxotrofii + reversní systém tj. mutanty disruptující interakce (na FOA)

  9. AD Y X transkripce DBD GAL1 UAS Reporter gen AD Y X Mat a buňky 8x12 jamek (96 na misku) Všechny ORF DBD Mat a buňky Kvasinkový „INTERACTOME“ Nature (2000) p. 623

  10. Protein „networks“ Buněčný cyklus RNA sestřih

  11. Reversní systém (Y2H) • Při použití URA3 reportéru lze použít toxickou 5-fluoro-orotátovou kyselinu (5-FOA) k negativní selekci tj. interakce povede k záhubě kvasinek, zatímco mutanty neschopné interakce na FOA plotnách porostou (mutanty nebo syntetické látky) TIBTECH (1999) p. 374

  12. Split-hybrid systém PNAS (1996) p. 13896

  13. Klasický dvojhybridní systém Trojhybridní systém – heterotrimerní proteinové komplexy - posttranslační modifikace Trojhybridní systém - proteinový inhibitor interakce Trojhybridní systém – RNA interakce - ligand/receptor

  14. Interakce vyžadující post-translační modifikace AD Y X enzym DBD transkripce GAL1 UAS minimální Reporter gen • - Některé protein-proteinové interakce jsou závislé na post-translačních modifikacích • v buňce jsou přítomny např. acetylasy i deacetylasy, ale nemusí docházet k acetylaci hybridního proteinu – řešením je „připojení“ příslušného enzymu k hybridu • konstitutivní modifikace a každý enzym ve stechiometrickém poměru k substrátu (nejsou nutné kofaktory regulující interakci/modifikaci) Nat Biotech (2004) p. 888

  15. Analýza vazby protein-RNA (Y3H) FEBS letters (2004) p. 7 PNAS (1996) p. 8496

  16. Vazba ligand-receptor (Y3H) glucocorticoid receptor - FKBP12 dexamethasone FK506 PNAS (1996) p. 12817

  17. Inhibitory proteinových interakcí A B A-B nano-kapky FK506 připojen na kuličky přes fotolabilní raménko - po uvolnění začínají kvasinky růst PNAS (1997) p. 13396

  18. Dihydrofolát reduktása/methotrexát Aktivní DHFR je vytvořena propojením dvou separovaných částí enzymu – odbourává pro kvasinky toxický methotrexát Science (2008) p. 1465

  19. CytoTrap 2-hybridní systém Kvasinkový cdc25-2 ts mutant - hSOS (guanine exchange factor) aktivuje RAS pokud je ukotven na membránu v jeho blízkosti - jeden partner je myristylován a ukotven na membránu a druhý (interakční) partner je fuzován k hSOS Cell growth Cur Biol (1998) p. 1121

More Related