Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali

1. “SAPIENZA - Università di Roma” Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali Corso di Laurea Magistrale in Biotecnologie Genomiche, Industriali e Ambientali Ruolo del Long non-coding RNA Kcnq1ot1 nella regolazione dell’espressione di p57 durante il differenziamento muscolare Candidato Oriella Andresini Relatore Prof. Carlo Presutti Correlatore Prof.ssa Rossella Maione ANNO ACCADEMICO 2013/2014

2. Introduzione Differenziamento muscolare • processo facilmente ricapitolabile in vitro; • permette di studiare gli eventi molecolari alla base del differenziamento di un tessuto.

3. Duplice ruolo di MyoD MyoD non attivo MyoD attivo Arresto del ciclo cellulare: ↑ CKI (p57 e p21) ↓Ciclina-CDK ↓pRB Attivazione dei geni muscolo-specifici: ↑MRFs ↑α-actina, MHC, MLC1 MyoD attivo

4. p57 • Profilo spaziale e temporale molto specifico: è presente nella maggior parte degli organi durante lo sviluppo embrionale e nell’adulto la sua espressione è ristretta solo al cuore, muscolo, cervello, polmone e rene; • Unica Cip/Kip la cui ablazione comporta difetti nello sviluppo; (Pateras et al, 2009)

5. Dominio genomico di p57 Il gene che codifica per p57 mappa in un dominio soggetto ad imprinting, altamente conservato tra uomo (11q15.5) e topo (estremità distale del cromosoma 7) Materno Paterno X X 150 Kb 150 Kb Kcnq1 Chr 7 topo Chr 11 uomo p57 Chr 7 topo Chr 11 uomo p57 Kcnq1 Kcnq1ot1 X Kcnq1ot1 KvDMR1 KvDMR1 CpG metilato CpG non metilato

6. Regolazione di p57 nel muscolo p57 viene indotto da MyoD (Figliola AND Maione, 2004): Legame di fattori in trans indotti da MyoD (Vaccarelloet al, 2006, Figliola et al, 2008) III) Interazioni longe-range che permettono l’avvicinamento spaziale tra il promotore di p57 e la KvDMR1 (Busanelloet al, 2012; Battistelli et al, 2014); IV) Modificazioni dello statodi metilazione del promotore di p57 (Figliola et al, 2008).

7. I) Legame di fattori di trascrizione sul promotore (Vaccarelloet al,2006; Figliola et al, 2008); MyoD non lega direttamente il promotore di p57 ma ne induce l’attività tramite un meccanismo indiretto che prevede la mediazione di altri fattori transattivanti

8. Kcnq1 II) Interazioni longe-rangeche permettono l’avvicinamento spaziale tra il promotore di p57 e la KvDMR1 150 Kb Siti di legame per CTCF Siti di legame per MyoD p57 Kcnq1ot1 Promotore di p57 KvDMR1 KvDMR1 KvDMR1 p57p F1 F2 F3 (Busanello et al,2012; Battistelli et al,2014)

9. III) Modificazioni dello stato di metilazione del promotore di p57 Proliferanti Differenziate p57 p57 Mioblasti (Figliola et al, 2008) CpG metilate CpG non metilate

10. Scopo della tesi Investigare il possibile ruolo di Kcnq1ot1 nella regolazione dell’espressione di p57 durante il differenziamento muscolare Kcnq1 p57 KvDMR1 • E’ un Natural Antisensetrascript (NAT) di 91Kb; • Localizzazione nucleare; • Il suo promotore mappa nella KvDMR1 ed è metilato sull’allele materno e de-metilato sul paterno; • Partecipa al silenziamento del dominio interagendo con i promotori dei geni silenti e reclutandovi la DNMT1 e modificatori epigenetici tra cui PCRII e G9a (Pandeyet al,2008); Kcnq1ot1 (Kanduriet al, 2011)

11. Fasi della ricerca Livelli d’espressione di Kcnq1ot1 durante il differenziamento muscolare; Interazione di Kcnq1ot1 con la cromatina nello stato proliferante e differenziato; Associazione cromatinica di Kcnq1ot1 con p57 durante la miogenesi; Effetto della deplezione di Kcnq1ot1 sull’espressione di p57 nei miotubi differenziati; Interazione di Kcnq1ot1 con MyoD nei miotubi differenziati.

12. Risultati Livelli d’espressione di Kcnq1ot1, p57e Miogenina durante il differenziamento muscolare; Livelli d’espressione Tempi precoci di differenziamento RT-qPCR Livelli d’espressione Tempi tardivi di differenziamento RT-qPCR Espressione normalizzata su Tbp Espressione normalizzata su Tbp 8h 16h 24h 48h 48h prol 16h prol 8h 24h prol 48h 72h 72h 96h 24h prol 24h 24h 8h 16h 48h 24h 96h prol 48h 96h prol 48h 72h Kcnq1ot1 Miogenina p57 Kcnq1ot1 Miogenina p57

13. 2. Interazione di Kcnq1ot1 con la cromatina nello stato proliferante e differenziato Chromatin RNA Immunoprecipitation

14. 2. Interazione di Kcnq1ot1 con la cromatina nello stato proliferante e differenziato H3 ChIP qPCR Livelli d’espressione totali di Kcnq1ot1 RT-qPCR Espressione normalizzata su Tbp IP/Input DM DM GM GM Kcnq1ot1 associato alla cromatina RT-qPCR IP/Input normalizzati su Tbp GM DM GM noRT DM noRT

15. 3. Associazione cromatinica di Kcnq1ot1 con p57 durante la miogenesi Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP qPCR Crosslinking Sonicazione Ibridazione Oligonucleotidi biotinilati % Input Lavaggi per eliminare le interazioni aspecifiche Purificazione con beads magnetiche contenenti streptavidina RNase A e H prol prol prol prol prol 24h 24h 24h 24h 24h 48h 48h 48h 48h 48h F3 Kcnq1 prom p57 p57 prom Timm prom DNA genomico

16. 4. Effetto della deplezione di Kcnq1ot1 sull’espressione di p57 nei miotubi differenziati siRNA RT-qPCR Espressione normalizzata su Tbp siGFP siOT1 siOT1 siGFP Kcnq1ot1 p57 Kcnq1ot1 ha un ruolo nel limitare l’espressione di p57 durante il differenziamento muscolare

17. 5. Analisi dell’ interazione di Kcnq1ot1 con MyoD nei miotubi differenziati RNA immunoprecipitation Proteina d’interesse Altre proteine RIP RT-qPCR RNA Anticorpo Beads magnetiche magnete IP/Input IP IP No RT No Ab No Ab No RT Kcnq1ot1 Tbp

18. Conclusioni • I livelli d’espressione di Kcnq1ot1 sono poco modulati durante il differenziamento • muscolare; • Interagisce con la cromatina globale e in particolare con il gene di p57 sia nelle cellule proliferanti che differenziate; • La deplezione dell’espressione di Kcnq1ot1 correla con l’incremento dell’espressione • di p57 nei miotubi differenziati; • Kcnq1ot1 interagisce con MyoD nei miotubi differenziati.

19. Prospettive future I risultati suggeriscono un coinvolgimento di Kcnq1ot1 nella regolazione dell’espressione di p57 durante il differenziamento muscolare • Investigare il meccanismo di regolazione di Kcnq1ot1: • Espressione e legame allele-specifico di Kcnq1ot1 mediante l’utilizzo di fibroblasti murini polimorfici per il dominio d’interesse; • Stato di metilazione di p57 in seguito a deplezione dell’espressione di Kcnq1ot1 mediante sequenziamento dopo trattamento del DNA con bisolfito; • Interazione funzionale di Kcnq1ot1 con la DNMT1; • Effetto della deplezione di Kcnq1ot1 sul legame di MyoD alla KvDMR1 mediante ChIP e della struttura tridimensionale del dominio mediante ChromosomeConformationCapture(3C)

20. Grazie per l’attenzione !!! Ringraziamenti Prof.ssa Rossella Maione Marianna Rossi Cecilia Battistelli Agnese Ciotti Mariarosaria Carbone Cassandra Mostocotto