Nachweis von Proteinen aus

1. WESTERN BLOThttp://www.wiley.co.uk/reecegenes/animations.htmlIst die Bezeichnung für eine Methode, bei der elektrophoretisch aufgetrennte Proteine aus einem Trenngel auf ein Trägermaterial übertragen werden um dann z.B. mittels Antikörper nachgewiesen zu werden.

2. „Although gel electrophoresis is a relatively simple technique, it is not a trivial procedure.“David E. Garfin, Electrophoretic Methods(even more true for blotting...)

3. Nachweis von Proteinen aus • Blut (z.B. Virusinfektion, Schwangerschaftstest) • Zellen • Geweben • Harn ( Blasenentzündung) • Lebensmittel (Toxine)

4. Übersicht 1. Probenvorbereitung 2. Elektrophorese 3. Blotting 4. Nachweis 4.1 Blockierung 4.2 Bindung primärer Antikörper 4.3 Waschschritte 4.4 Bindung sekundärer Antikörper 4.5 Waschschritte 4.6 Substratreaktion 5. Kontrollen 6. Weitere Tipps Anhang

5. Probenvorbereitung • Bestimmung der Proteinmenge mittels verschiedener Messmethoden möglich 1.) Bradford 2.) Biuret 3.) Christian Warburg (photometrische Differenzmessung)

6. Bradford (Comassie Blue) • Triphenylfarbstoff Absorptionsmax 465 nm (Rot) • WW mit Protein in saurer Lösung Absmax shiftet zu 595 nm (Blau): Farbänderung durch Stabilisierung des Farbstoff-Anions mittels hydrophober und ionischer WW mit dem Protein • Farbstoff reagiert mit Arginin!!! Histidin, Lysin, Tyrosin, Tryptophan, Phenylalanin • Messbereich 0,2-1,5 mg/ml • Ungeeignet für kleine basische Polypeptide • Detergenzien über 0,2 % stören die Messung (NaOH, SDS) • Globulin für Eichgerade geeignet • Nachteil: destruktiv!!!

7. Biuret • Biuret Reagenz enthält CuSO4 in alkalischer Lösung • Cu++ Ionen bilden mit den Peptidbindungen einen blauen Komplex • Messung bei 546 nm • Messbereich 1-10 mg/ml • Nachteil: destruktiv Warburg-Christian • Proteine zeigen im UV ein Maximum bei 280nm (Tryptophan und Tyrosin) • 2. Max. bei 200nm, Peptidbindung und einige AA • Nukleinsäuren zeigen Max. bei 260 nm • Berechnung: 1,55*E (280)-0,76*E(260)=mg/ml • Messbereich 1-10 mg/ml • Vorteil: Proteine werden nicht zerstört und können für weitere Analysen verwendet werden.

8. Probenvorbereitung • (Bestimmung der Proteinmenge) • Denaturierung der Proteine 1% SDS (Sodiumdodecylsulfat) Harnstoff Mercaptoethanol Dithiothreitol andere SH-Verbindungen • Erhitzen der Proteine (5-10 min auf 95°C) • Einfärben der aufzutragenden Probe mit Comassie Blue • Etwa 15-25 µg Protein/slot auftragen • 1µg Protein/Bande damit Bande sichtbar ist!

9. Elektrophorese • Trägermaterialien Papier Acetatfolien Agarose Polyacrylamidgel • Polyacrylamidgel (PAGE) Wanderungsgeschwindigkeit der Proteine abhängig von: unterschiedlicher Ladung unterschiedlicher Molekulargewichte Porengröße des Gels (6%-15%)

10. SDS (Sodium dodecyl sulfate) • Anionisches Detergens • Bewirkt folgendes: Ladungsunterschiede werden aufgehoben Wasserstoffbrücken gespalten hydrophobe WW werden aufgehoben Aggregatbildungen von Proteinen verhindert Polypeptidfäden werden gestreckt Proteine aus Untereinheiten werden zu Monomeren • Proteine binden SDS in konstantem Verhältnis mit Disulfidbrücken: 70-100% ohne Disulfidbrücken: 140%

11. SDS Gelsysteme Eindimensionale Gele • Einheitliches Gelsystem (kontinuierliches Gel) • Lämmli Gel (diskontinuierliches Gel) Sammelgel zum Konzentrieren der Proben Trenngel • Gradientengele (Porengröße ändert sich linear oder exp) • Mischgele (aus Polyacrylamid und Agarose) Zweidimensionale Gele • O´Farrell Gele: 1. Dimension: Auftrennung nach ieP 2. Dimension: SDS PAGE

12. Kontinuierliches Puffersystem • Gleiche Puffer für das ganze Elektrophoresesystem • Einheitliches Polyacrylamidgel • Nachteil: Proben müssen hochkonzentriert sein geringe Probenvolumina jede Bande ist so breit wie aufgetragene Probenbande

13. Diskontinuierliches Puffersystem • Verschiedene Puffer um pH-Gradienten und Spannungsgradienten zu erzeugen • Stabilisierung der Puffer durch verschiedene Polyacrylamidschichten: Sammelgel (weitporig, geringvernetzt) Trenngel (engmaschig, Auftrennung der Proteine nach Größe)

14. Trenngel • Auftrennung im Trenngel allein nach Größe des Proteins • Nicht vergessen: Standard für Eichgerade!!! • Achtung: monomeres Acrylamid ist hochgiftig!!!

15. Färben der Gele • Zur Sichtbarmachung der Proteinbanden • Zur Kontrolle ob die Proteine gut gelaufen sind • Zur Kontrolle ob gleiche Mengen an Protein aufgetragen wurde. Entfärben der Gele • Damit Gel zum Blotten verwendet werden kann

16. Trouble Shooting: Elektrophorese • Prozentigkeit der Gele auf die Proteingröße abstimmen, evtl. Gradientengel probieren • 7,5 % Gele 40 – 200 kDa • 10 % Gele 30 – 100 kDa • 12 % Gele 15 – 90 kDa • 15 % Gele 10 – 70 kDa (Werte für SDS-PAGE) • Gellösungen partikelfrei; Salze komplett gelöst • Gel luftblasenfrei gießen

17. Trouble Shooting: Elektrophorese • Slots vorspülen (Gelbruchstücke/Salze)! • Gleiche Gesamtvolumina und möglichst gleiche Proteinmengen auftragen • Falls möglich Positivkontrolle mitlaufen lassen (gereinigtes Protein; positiver Extrakt) • Gel nicht zu schnell fahren, sonst smile-Effekt (Wärmeentwicklung!) • Große Gele kühlen • Nach Elektrophorese eine Standardlane mit Coomassie anfärben

18. Blotten • Übertragung der Proteine von Gel auf Nitrocellulose (PVDF) Produktion einer Kopie des Gel, wobei die Proteine auf dem Filter immobilisiert werden. • Trennmuster bleibt am Filter erhalten • Nachdem welches Gel benutzt wurde, Erhaltung der Immunreaktivität Funktionellen Aktivität (z.B. Enzymaktivität) • Nach Transfer mögliche Behandlung der Proteine mit: Liganden Antikörper Enzymsubstraten • Präparative Reinigung des Proteins möglich (durch Ablösen von der Transfermembran)

19. Vorteile des Blottens • Qualitative Bestimmung des Proteins • Quantitative Bestimmung des Proteins • Präparative Reinigung • Indentifizierung (z.B. mittels Antikörper: Immunoblotting) direkter Nachweis Enzym konjugierte Antikörper (HRP, ß-Gal..) anders markierte Antikörper (Gold, Biotin, Luminiszenz) indirekter Nachweis ein bereits gebundener, spezif. Antikörper wird durch einen Sekundärantikörper (ebenfalls markiert) nachgewiesen.

20. Bestimmung der Transfereffizienz • Anfärben des Gels mit Coomassie Blau oder Silber (=> nicht geblottete Proteine) • Anfärben einer Referenzspur der Membran mit • Ponceau S Rot (schnell, aber nicht sehr sensitiv) • Amidoschwarz (2-5fach sensitiver als Ponceau) • India Ink • Coomassieblau (nur für PVDF empfohlen)

21. Protein-Nachweis: Blockierung • Blockierungsreagenzien (in TBS oder PBS): • Milchpulver (fettarm, 1 – 5 %) • BSA (3 – 5 %) • Casein (1 - 3% für NC, 0,5 – 1,0 % für PVDF) • Ovalbumin (1 %) • Gelatine (3 %, nur NC) • 0,05 – 0,1 % Tween 20 (nur PVDF) • Wenn Antikörper gegen Phosphorelierungen eingesetzt werden kein BSA oder Milchpulver verwenden • Mind. 0,3 ml Blockierungslösung pro cm² Membran; für 1 h bei RT (oder ÜN 4°C)

22. Bindung primärer Antikörper • 0,5 – 10 µg/ml primärer AK in Blockierungslösung verdünnen (0,3 ml/cm² Membran) – optimale Konzentration des AK austesten (Kompromiss zwischen Signalstärke und Hintergrund)! • 1 (– 2) Stunden inkubieren, je nach Affinität und Konzentration des AK

23. Waschschritte • Abhängig von der Affinität des AK und auch der Spezifität kann/muss mehr oder weniger stark gewaschen werden • Polyklonale Seren sind weniger anfällig gegenüber zu starkem Waschen • Monoklonale Seren zeigen weniger Kreuzreaktivitäten

24. Bindung sekundärer Antikörper • Vom Hersteller empfohlene Konzentration vom sek. AK in Blockierungslösung einsetzen (mind. 0,3 ml/cm² Membran) • 0,5 - 1 Stunde inkubieren

25. Substratreaktion • Meerrettich-Peroxidase (HRP) • Sehr schnelle Reaktion; nimmt schnell ab • Alkalische Phosphatase (AP) • Reaktion beginnt langsamer, hält dafür länger an; ist insgesamt stärker • Chemoluminineszenz ca. 10fach sensitiver als Colorimetrie

26. Vergleich HRP – AP Chemolumineszenz • AP-Substratblatt • AP-Substrat flüssig • HRP-Substrat Die Fläche unter der Kurve ist proportional zur Schwärzung des Films!

27. Summary-Western Blot • Technik zum Nachweis von Proteinen Qualitativ Quantitativ Präparativ • Häufige Anwendung in der Diagnostik Viren Bakterien Allergene Hormone • Einfache Methode