Strategie regulace (proteinové) enzymové aktivity.

1. Strategie regulace (proteinové) enzymové aktivity. 1. Reversibilní kovalentní modifikace. Katalytické vlastnosti řady enzymů se mění po kovalentní vazbě nějaké skupiny na jejich molekulu – nejčastěji fosforylace. Modifikující enzymy jsou proteinkinasya proteinfosfatasy. 2. Allosterická kontrola. Allosterické proteiny obsahují regulační místa odlišná od substrátových. Allosterický z řečtiny „allos“ = další, „steros“ = uspořádání. Skládají se z podjednotek (protomerů). Mají schopnost kooperativity. Jako příklady enzym aspartáttranskarbamoylasa (ATCasa) a neenzymový kyslíkový přenašeč hemoglobin. 3. Mnohočetné formy enzymů. Isozymy – jsou homologní enzymy katalyzující stejnou reakci, ale lišící se jemně ve struktuře a více v Km a Vlim a regulačních vlastnostech.

2. 4. Proteolytická aktivace. Mnoho proteinů je syntetizováno v neaktivní formě. U enzymů jsou to zymogeny (proenzymy). Po odštěpení části řetězce přechází zymogen na aktivní enzym. Jako aktivující složky působí proteolytické enzymy jako chymotrypsin, pepsin a trypsin. Aktivace je ireversibilní. Kaspasy, proteolytické enzymy, účastnící se programové buněčné smrti, jsou aktivovány z formy prokaspas. Dalším příkladem je kaskáda enzymů při srážení krve. 5. Kontrola množstvím přítomného enzymu-kontrola na úrovni transkripce. Modul 11, ibiochemie.upol.cz; Regulace genové exprese. (P. Peč).

3. 1. Regulace enzymové aktivity kovalentní modifikací. • Nejčastější jsou fosforylace a defosforylace • Dalším způsobem modifikace je např. acetylace. Acetylovány jsou histony (pomocné proteiny obalující DNA v chromosomech a při regulaci genů). Vysoce acetylované histony spojené s geny jsou aktivně přepisovány. Enzymy jsou acetyltransferasa a deacetylasa a jsou regulovány fosforylací. • Modifikace není vždy reversibilní. Např. připojení ubiquitinu k proteinu.

4. Kovalentní modifikace proteinů – acetylace vedlejšího řetězce Lys

5. Sirtuiny: EC 3.5.1.98 histondeacetylasy nebo histonamidohydrolasy. Protipólem jsou histonacetylasy EC 2.3.1.48 • Sirtuiny (silent information regulator, SIRT) jsou enzymy kódované skupinou vysoce konzervovaných genů přítomných v genomech organismů počínaje archebakteriemi až po eukaryota. • Tyto enzymy patří do skupiny NAD+-dependentních deacetylas katalyzujících deacetylaci různých proteinů včetně histonů, p53, p300, acetyl-CoAsynthetasy a R-deacetylacitubulin. • Schopnost deacetylace širokého spektra substrátů určuje klíčovou roli sirtuinů při různých biologických funkcích jako je např. oprava DNA, umlčení transkripce, stabilita genomu, apoptosa, signál insulinu a mobilizace tuků.

6. Sirtuiny • Sirtuiny – regulace umlčování genů. Sirtuiny vyžadují pro deacetylaci např. histonů NAD+. Tato skupina enzymů slouží jako citlivý senzor energetického stavu buňky. • Pokud je k dispozici dostatek živin a metabolismus pracuje na plné obrátky, vzniká velké množství NADH (inhibitor sirtuinů). Naopak, pokud nevzniká velké množství NADH nebo je veškerý NADH převeden na NAD+, díky zvýšené aktivitě dýchacího řetězce, sirtuiny nerušeně fungují. • Co sirtuiny umějí ? • U kvasinek bylo zjištěno, že větší množství sirtuinů vede k prodloužení života. Omezený přísun potravy (glukosy) vede k poklesu NADH, sirtuiny jsou aktivovány a deacetylují. Pustí se do histonů a dalších substrátů, které se podílejí na délce života.

7. Sirtuiny • U savců (u laboratorních myší) je nejdůležitějším enzymem SIRT1. K jeho substrátům patří proteiny p53 nebo MyoD, které jsou zapojeny do programované buněčné smrti. • Další cestou vlivu SIRT je tuková tkáň, kde interaguje s transkripčním faktorem PPAR gama a touto cestou brání tvorbě proteinů nutných k syntéze tuků. Tuky jsou místo uskladňování odbourávány. • SIRT brzdí programovou buněčnou smrt i diferenciaci, mobilizuje zásoby tuků a. umožňuje jejich lepší spalování. Větší počet mitochondrií produkuje méně ROS. • Účinnost SIRT lze zvýšit podáním resveratrolu, což je přírodní polyfenolická látka vyskytující se např. v hroznové slupce a jadérkách. Francouzský paradox !!

8. Resveratrol

11. Vysvětlivky k tabulce: Common covalent modification of protein activity • Ras = onkogen – rat sarcoma viruses. • Src = onkogen – Rous sarcoma viruses. • Myristoyl-CoA = CH3 – (CH2)12 – CO-CoA • Farnesylpyrofosfát (3 x prenyl, prenylace) –

12. Fosforylace je vysoce účinný způsob modifikace regulující aktivitu cílového proteinu.

14. Pyruvátdehydrogenasakinasa (PDK) EC 2.7.11.2 • PDK inaktivuje pyruvátdehydrogenasu fosforylací za účasti ATP. • PDK se podílí na regulaci pyruvátdehdrogenasového komplexu jehož je PD prvním enzymem. PDK a pyruvátdehydrogenasový komplex jsou lokalizovány v matrix mitochondrií u eukaryot. • Komplex převádí pyruvát, jako produkt glykolýzy vzniklý v cytoplasmě, na acetyl CoA., který je posléze oxidován v citrátovém cyklu za tvorby energie. • PDK snižuje oxidaci pyruvátu v mitochondrii a zvyšuje převod pyruvátu na laktát v cytoplasmě. • Opačné působení PDK- defosforylace – a aktivace pyruvátdehdrogenázového komplexu je katalyzováno fofoproteinfosfatasou nazývanou pyruvátdehydrogenasafosfatasa.

15. Regulace pyruvátdehydrogenasového komplexu

16. Pyruvátdehdrogenasakinasa (PDK) EC 2.7.11.2 • PDK je stimulována ATP, NADH a acetyl CoA. • PDK je inhibována ADP, NAD+ CoA-SH a pyruvátem. • PDK je také inhibována farmakem dichloroacetátem, který je sledován jako prostředek k léčení několika metabolických onemocnění – zvláště proti rakovině. • PDK má čtyři isozymy – PDK1 až PDK4.

17. Složení pyruvátdehydrogenasového komplexu: Pyruvátdehydrogenasa (E1) Dihydrolipoyltransacetylasa (E2) Dihydrolipoyldehydrogenasa (E3) Např. komplex E. coli je 4 600 kD proteinový komplex. Mitochondriální komplex je 10 000 kD protein, obsahující 20 E2 trimerů obklopených 30 E1 heterotetramery a 12 E3 dimerů. Pyruvátdehydrogenasový komplex katalyzuje sekvencí tří reakcí, sumárně: Pyruvát + CoA + NAD+→ acetyl CoA + CO2 + NADH Komplex využívá pěti různých koenzymů: Thiaminpyrofosfát (TPP), koenzym A (CoA SH), NAD+, FAD a lipoamid. 17

18. Thiaminpyrofosfát – TPP, také thiamindifosfát TDP. Váže se pevně, ale nekovalentně na pyruvátdekarboxylasu. Prekurzorem je vitamin B1 – thiamin.

19. Nekovalentní vazba TPP na pyruvátdekarboxylasu.

20. Pyruvátdehydrogenasa (E1)Pyruvát dekarboxyluje za tvorby hydroxyethyl-TPP meziproduktu. 20

21. Lipoamid a dihydrolipoamid. Lipoová kyselina je vázána na E2 amidovou vazbou přes e-aminoskupinu Lys. 21

22. Hydroxyethylová skupina je přenesena na dihydrolipoyltransacetylasu (E2).Hydroxyethylový karbanion je současně oxidován na acetyl a lipoamid redukován na disulfid. 22

23. E2 (Dihydrolipoyltransacetylasa) poté katalyzuje transesterifikací, při které se acetyl přenese na CoA za tvorby acetyl-CoA. 23

24. Regenerace lipoamidu na E2. Reoxidace probíhá přes kovalentně vázaný FAD. 24

25. Reoxidace redukovaného E3 (Dihydrolipoyldehydrogenasa ). Elektrony z FADH2 se přenáší na NAD+ za tvorby NADH. FAD slouží spíše jako vodič elektronů !!! 25

26. Aktivní místo dihydrolipoamiddehydrogenasy. FAD Cys43 Cys48 NAD+ Tyr 181

27. Lipoyllysylové raménko E2 (2x) Raménko přenáší meziprodukty reakce mezi jednotlivými enzymy. 27

28. Animace PD • http://www.brookscole.com/chemistry_d/templates/student_resources/shared_resources/animations/pdc/pdc.html

29. Toxicita arsenitanu a organických sloučenin arsenu. Inhibují pyruvátdehydrogenasu a 2-oxoglutarátdehydrogenasu a tím i respiraci. 29