Fermentacyjne technologie wytwarzania enzymów i białek terapeutycznych wysokiej wartości

1. Fermentacyjne technologie wytwarzania enzymów i białek terapeutycznych wysokiej wartości

2. Produkcja enzymów

3. Warunki wytwarzania enzymu rekombinowanego • Producent bakteryjny– zwykle szczep E. coli zawierający plazmid • kodujący enzym w wektorze z markerem oporności na antybiotyk • i obszar induktorowy. • Fermentacja okresowa z zasilaniem. Wzrost początkowy w pożywce • minimalnej (glukoza + ekstrakt drożdżowy + sole + antybiotyk). • W fazie początkowej wzrostu dodawanie składników odżywczych • w kontrolowany sposób. Źródło azotu – sole amonowe, mocznik. • Po osiągnięciu fazy intensywnego wzrostu – dodanie induktora. • Proces trwający 24 – 48 h w temperaturze 24 – 28 C. • Osiąga się do 50% ogólnej puli białek, z wydajnością 10 – 15 g/L • 2. Alternatywni producenci – drożdże (S. cerevisiae, Pichia pastoris), • grzyby – Aspergillus, Fusarium. Gen zintegrowany z chromosomalnym • DNA + efektywny promotor. Pożywki z tanimi źródłami węgla i azotu. • Fermentacja 4 – 8 dni. Enzymy często wydzielane poza komórkę, • co obniża koszty izolacji.

4. Schemat technologiczny wytwarzania enzymu

5. Przykłady enzymów stosowanych w diagnostyce Enzym Źródło (oryginalne) Stosowany do oznaczania ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Oksydaza cholesterolowa Nocardia erythropolis Cholesterol lub Brevibacterium spp. Kreatynaza Pseudomonas spp. Kreatyna Kreatyninaza j.w. Kreatynina -galaktozydaza E. coli jony Na+, ELISA Oksydaza glukozowa Aspergillus niger Glukoza Dehydrogenaza Glc-6-P Leuconostoc mesenteroides Glukoza -glukozydaza S. cerevisiae aktywność -amylazy Oksydaza glicerolo-3-P Aerococcus viridians Triacyloglicerole Heksokinaza S. cerevisiae Glukoza Peroksydaza Chrzan Enzym wskaźnikowy, testy ELISA Oksydaza pirogronianowa Pediococcus spp. Pirogronian, transami- nazy Oksydaza kwasu moczowego Arthrobacter protopharmiae Kwas moczowy Ureaza Klebsiella aerogenes Mocznik

6. Białka rekombinowane terapeutyczne Białko Leczona choroba Rok zaakceptowania ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ Insulina Cukrzyca 1982 Ludzki hormon wzrostu Karzełkowatość 1985 Interferon alfa Wirusowe zapalenie wątroby niektóre nowotwory 1986 Szczepionka przeciwko wiru- sowemu zap. wątroby typu B Zapobieganie WZW typu B 1986 Aktywator plazminogenu Zawał serca, zator naczyniowy 1987 Erytropoetyna Anemia związana z niewydolnoś- cią nerek 1989 Interferon gamma Chroniczna granulomatoza 1990 Czynnik stymulujący granulocyty Neutropenia, stany po przesz- czepach szpiku 1991 Czynnik krzepliwości VIII Hemofilia A 1992 Interferon beta Stwardnienie rozsiane 1993 DNaza Zwłóknienie torbielowate 1994 Glukocerebrozydaza Choroba Gauchera 1994 Czynnik krzepliwości IX Choroba Christmasa 1997 Interleukina-10 Zapobieganie trombocytopenii 1997

7. Białka, które są glikoproteinami nie mogą być wytwarzane w komórkach bakteryjnych. Komórki grzybów wytwarzają glikoproteiny o innej budowie niż komórki ssacze.

8. Pierwsze białko terapeutyczne wytwarzane przez zwierzę transgeniczne Atryn, pierwszy lek pochodzący od zmodyfikowanego genetycznie zwierzęcia został dopuszczony do użytku w Europie przez Europejską Agencję do spraw Leków (EMEA) w roku 2006. Atryn jest uzyskiwany z mleka genetycznie zmodyfikowanych kóz, które mają gen kodujący antyrombinę – białko hamujące patologiczne krzepnięcie krwi. Niedobór antytrombiny – choroba o podłożu genetycznym (1 raz na 5 tys. osób). Jedna koza może zastąpić 90 000 ludzkich dawców krwi.

9. Naturacja białek z ciał inkluzyjnych Problem tworzenia agregatów podczas fałdowania białek 1. Liza komórek; 2. Wydzielenie ciał inkluzyjnych poprzez wirowanie; 3. Rozpuszczenie w roztworze 6-8 M mocznika (+ mieszania zredukowanego i utlenionego glutationu, w razie potrzeby); 4. Powolne usuwanie czynnika denaturującego – rozcieńczanie, dializa

10. Białka terapeutyczne rekombinowane I generacji • Insulina • Genentech, Eli Lilly • Osobna ekspresja łańcuchów A i B w E. coli jako białek fuzyjnych • z syntazą tryptofanową i -galaktozydazą; • Rozszczepienie bromocyjanem; • Połączenie łańcuchów przez chemiczną reoksydację • Novonordisk • Ekspresja proinsuliny w E. coli, potem usunięcie enzymatyczne

11. Białka terapeutyczne rekombinowane I generacji Gensulin (BIOTON) Konstrukcja genu: sekwencja kodująca Peptyd B-dipeptyd-Peptyd A-peptyd nośnikowy Ekspresja w Escherichia coli Produkt:białko fuzyjne w ciałach inkluzyjnych Etapy izolacji wstępnej: rozbicie komórek, izolacja ciał inkluzyjnych, naturacja Półprodukt: prekursor z mostkami disiarczkowymi Obróbka: rozcięcie hydrolityczne – oddzielenie peptydu nośnikowego oraz przecięcie wiązania peptydowego pomiędzy dipeptydem a peptydem A Oczyszczanie: chromatografia kolumnowa Dalsza obróbka: usunięcie dipeptydu przy użyciu karboksypeptydazy Produkt: insulina identyczna z ludzką, o czystości około 95% Dalsze oczyszczanie: HPLC, ekstrakcja, krystalizacja Produkt: insulina identyczna z ludzką, o czystości ponad 99,9%