Metody wytwarzania biofarmaceutyków Wytwarzanie białek terapeutycznych

1. Metody wytwarzania biofarmaceutyków Wytwarzanie białek terapeutycznych

2. Etapy opracowania procesu technologicznego dla wytwarzania białek terapeutycznych • Konstrukcja metodami inżynierii genetycznej • Izolacja genu, ewentualna modyfikacja • Dobór wektora klonowania • Konstrukcja wektora ekspresji • Dobór układu gospodarz-wektor • Biotechnologiczne opracowanie procesu technologicznego • Fermentacja • kolby wstrząsane • fermentor laboratoryjny • fermentor w skali pilotażowej • optymalizacja podłoża i prowadzenia procesu produkcyjnego • Obróbka • zbiór komórek • oczyszczanie wstępne • oczyszczanie dokładne • Opracowanie produktu • Opracowanie postaci leku • Testy farmakologiczne • Testy kliniczne • Dopuszczenie do obrotu

3. Warunki wytwarzania białek rekombinowanych • Producent bakteryjny– zwykle szczep E. coli zawierający plazmid • kodujący białko w wektorze z markerem oporności na antybiotyk • i obszar induktorowy. • Fermentacja okresowa z zasilaniem. Wzrost początkowy w pożywce minimalnej (glukoza + ekstrakt • drożdżowy + sole + antybiotyk).W fazie początkowej wzrostu dodawanie składników odżywczych • w kontrolowany sposób. Źródło azotu – sole amonowe, mocznik. Po osiągnięciu fazy intensywnego • wzrostu – dodanie induktora. Proces trwający 24 – 48 h w temperaturze 24 – 28 C. • Osiąga się do 50% ogólnej puli białek, z wydajnością 10 – 15 g/L • 2. Producent grzybowy – drożdże (S. cerevisiae, Pichia pastoris), • grzyby pleśniowe– Aspergillus, Fusarium. Gen zintegrowany • z chromosomalnym DNA + efektywny promotor. • Fermentacja 4 – 8 dni. Pożywki z tanimi źródłami węgla i azotu. • Białka często wydzielane poza komórkę, co obniża koszty izolacji. • Producent - komórki owadzie lub ssacze w hodowli tkankowej in vitro . • Komórki ludzkie – gen zmodyfikowany w obszarze promotora. CHO – • Chinese hamster ovary (komórki jajnika chomika chińskiego). BHK – • Baby hamster kidney (komórki nerki chomika). Komórki owadzie, • gen włączony w genom baculowirusa Autographa californica • Standard w przypadku wytwarzania przeciwciał (komórki hybrydowe). • 4. Transgeniczne rośliny lub zwierzęta

4. Wybór systemu ekspresyjnego Białka, które są glikoproteinami nie mogą być wytwarzane w komórkach bakteryjnych. Komórki grzybów wytwarzają glikoproteiny o innej budowie niż komórki ssacze.

5. Produkcja białek terapeutycznych Wymagania stawiane produkcji białek terapeutycznych – UE • Produkcja • Produkcja polega na zwalidowanym systemie posiewowym (seed lot system), w którym • używa się sprawdzonego, odpowiedniego układu gospodarz-wektor, dopuszczonego • do stosowania przez odpowiednie władze. System posiewowy obejmuje kultury mateczne • oraz kultury robocze, wyprowadzone z kultur matecznych. Konieczne jest wykonanie • szczegółowego opisu etapów hodowli, ekstrakcji oraz oczyszczania • Wykazanie zdatności układu gospodarz-wektor i walidacja systemu posiewowego muszą obejmować • następujące etapy: • Klonowanie i ekspresja • charakterystyka fenotypowa i genotypowa komórki gospodarza, jej pochodzenia oraz składu podłoży • hodowli komórkowej. • dokumentacja strategii klonowania dla genu i charakterystyka rekombinowanego wektora, • w tym analiza sekwencji DNA genu i flankujacych regionów kontrolnych • Charakterystyka układu gospodarz – wektor • mechanizm przenoszenia konstrukcji podlegającej ekspresji do komórek gospodarza • liczbę kopii, stan fizyczny i stabilność konstrukcji podlegającej ekspresji wewnątrz komórki gospodarza • środki indukcji i kontroli ekspresji • Walidacja kultur produkcyjnych • wykazanie stabilności przez pomiar przeżywalności • wykazanie identyczności komórek za pomocą właściwości fenotypowych • wykazanie, że kultury są wolne od kancerogennych lub zakaźnych czynników chorobotwórczych

6. Produkcja białek terapeutycznych Wymagania stawiane białkom terapeutycznym jako produktom finalnym – UE Konieczne wykonanie testów chemicznych, fizycznych, biologicznych i immunologicznych dotyczących identyczności, czystości, aktywności i stabilności. Dla białek ludzkich wymóg absolutny – wykazanie biozgodności – czyli identyczności produktu pod względem cech biologicznych z białkiem naturalnym. Przed uzyskaniem decyzji zwalniającej producent musi każdą serię produktu sprawdzić pod względem identyczności i czystości. W szczególności konieczne wykonanie analizy składu aminokwasowego oraz częściowej analizy sekwencji aminokwasowej i sposobu połączenia łańcuchów polipeptydowych (mostki disiarczkowe).

7. Wytwarzanie i izolacja białka terapeutycznego Schemat ideowy produkcji rekombinowanej stafylokinazy

8. Wykorzystanie S-transferazy glutationowej (GST) jako narzędzia w oczyszczaniu rekombinowanych białek. Białko docelowe jest syntezowane jako białko fuzyjne z GST. Komórki producenta poddawane są lizie i białko fuzyjne zostaje związane na kolumnie z wypełnieniem Glutathione-Sepharose. Po przemyciu złoża, białko docelowe oddziela się od złoża w wyniku działania proteazy rozszczepiającej białko fuzyjne.

9. Naturacja białek z ciał inkluzyjnych Problem tworzenia agregatów podczas fałdowania białek Mogą się tworzyć w bakteryjnych systemach ekspresji 1. Liza komórek; 2. Wydzielenie ciał inkluzyjnych poprzez wirowanie; 3. Rozpuszczenie w roztworze 6-8 M mocznika (+ mieszania zredukowanego i utlenionego glutationu, w razie potrzeby); 4. Powolne usuwanie czynnika denaturującego – rozcieńczanie, dializa

10. Mikroinjekcja DNA do zapłodnionego jaja myszy

11. Transgeniczne krowy jako producenci białek terapeutycznych Krowa może dostarczać rocznie 5 – 10 tys. litrów mleka. Litr mleka może zawierać około 50 g białka będącego produktem transgenu. Projekt argentyński – cztery transgeniczne krowy zawierające gen kodujący ludzką insulinę. Uważa się, że w przypadku powodzenia projektu, 25 krów transgenicznych wystarczy dla zaspokojenia potrzeb wszystkich diabetyków w Argentynie (1,5 mln osób). Pozyskiwanie preparatu zawierającego białko terapeutyczne?

12. Białko jaj • Doskonałe źródło rekombinowanych białek • Kura znosi rocznie ok. 300 jaj, a każde jajo zawiera ok. 6,5 g białka • Silny promotor genu owoalbuminy, zdolny wydajnie kierować ekspresją transgenu • w jajowodach transgenicznych kur, zapewnia możliwość produkcji ok. 2 g białka/jajo • Obecnie drugie po mleku potencjalne źródło biofarmaceutyków z wydzielin zwierząt transgenicznych • Trwają prace nad erytropoetyną, G-CFS • i przeciwciałami z jaj

13. Białka terapeutyczne - przykłady Białka stymulujące powstawanie komórek krwi Hematopoeza Proces powstawania i różnicowania się komórek krwi (krwinek) obejmujący zachodzące w szpiku kostnym dorosłych ssaków procesy powstawania krwinek czerwonych i białych oraz wytwarzanie limfocytów w obrębie układu limfatycznego Hematopoetyczne czynniki wzrostowe Białka stymulujące końcowe etapy różnicowania komórek macierzystych Szpiku Neutropenia Stan kliniczny, w którym liczba leukocytów spada o dwa rzędy wielkości poniżej limitu Anemia Spadek poziomu eytrocytów

14. Białka terapeutyczne - przykłady Białka stymulujące powstawanie komórek krwi Erytropoetyna Etapy ERYTROPOEZY a) krew przenosi za mało tlenu; b) informacja o tym dociera do nerki c) rozpoczyna się produkcja hormonu erytropoetyny (EPO) d), e) pod wpływem EPO szpik kostny wytwarza czerwone krwinki

15. Białka terapeutyczne - przykłady Białka stymulujące powstawanie komórek krwi Erytropoetyna • Ludzka EPO i rekombinowana ludzka EPO są identyczne pod względem • sekwencji aminokwasów, • pozycji 2 mostków disiarczkowych, • 4 miejsc glikozylacji, • struktury drugorzedowej. Peptyd zawiera 165 aminokwasów, masa cząsteczkowa - 30,4 kDa. Białko zbudowane jest z 4 alfa helis, które tworzą ścisłą pofałdowana strukturę białka. Rekombinowane produkty nie różnią się pod względem budowy, można jednak zauważyć ilościowe różnice w glikozylacji.

16. Erytropoetyna jako LEK EPO odgrywa bardzo dużą rolę w leczeniu niedokrwistości w przebiegu niewydolności nerek i u osób dializowanych. Obecnie stosuje się wyłącznie postacie rHu-EPO. Preparaty EPO alfa i beta nie różnią się działaniem leczniczym. W Polsce dostępne są preparaty o nazwie handlowej Neorecormon oraz Eprex. Tradycyjnie zalecane jest dawkowanie 3 razy w tyg. podskórnie 150–300 IU/kg. Znacznie wygodniejszym sposobem podawania leku przy podobnej skuteczności okazało się wstrzyknięcie hormonu raz w tygodniu w dawce 30 tys. IU. Pacjenci, którzy otrzymują EPO muszą mieć kontrolowany poziom żelaza, ponieważ jego zasoby w organizmie są wykorzystywane do produkcji hemoglobiny.

17. Erytropoetyna jako LEK Biorąc pod uwagę przede wszystkim wygodę chorych, a także usprawnienie pracy personelu medycznego, podjęto próby wynalezienia preparatów EPO, charakteryzujących się wydłużonym czasem działania, co umożliwić mogłoby podawanie leku w dłuższych odstępach czasu przy zachowanej skuteczności w zakresie wyrównywania niedokrwistości. MODYFIKACJE: EPO o zwiększonej liczbie przyłączonych cząsteczek kwasu sialowego. Modyfikacjia struktury hormonu w taki sposób, aby zmienić jego powinowactwo do receptora dla EPO. Darbepoetyna CERA

18. Białka terapeutyczne - przykłady Białka stymulujące powstawanie komórek krwi Czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF) Czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów i granulocytów (GM-CSF) G-SCF Glikoproteina, 174 aa, Układy ekspresyjne: CHO, E. coli ; nieglikozylowany także aktywny Przykładowy lek: Neupogen (Filgrastim), MW 18.8 kDa; nieglikozlylowany; wytwarzany w E. coli GM-SCF Glikoproteina, 127 aa; Układy ekspresyjne: CHO, BHK, S. cerevisiae Przykładowy lek: Leukine (Sagramostim),produkcja w S. cerevisiae; mieszanka trzech form o MW 19,5; 16,8 i 15,5 kDa. W stosunku do ludzkiej rózni się substytucją Leu23 i glikozylacją

19. Białka terapeutyczne - przykłady Czynniki krzepliwości krwi i antykoagulanty Stymulacja krzepnięcia w przypadku zaburzeń krzepliwości o podłożu genetycznym Hamowanie krzepnięcia i rozpuszczanie skrzepów w przypadku np. udaru mózgu i zawału serca

20. Białka terapeutyczne - przykłady Czynniki krzepliwości krwi i antykoagulanty Czynnik krzepliwości IX Glikoproteina, 415 aa, MW 55 kDa Przykład produktu: BeneFix; producent CHO Czynnik krzepliwości VIIA Glikoproteina, 406 aa, MW 50 kDa Przykład produktu: NovoSeven; producent BHK, pierwotny produkt jest wydzielany do pożywki jako pojedynczy łańcuch i następnie poprzez autokatalityczna proteolizę przekształcany w aktuwną formę dwułańcuchowa.

21. Białka terapeutyczne - przykłady Czynniki krzepliwości krwi i antykoagulanty Hirudyna Specyficzny inhibitor trombiny wytwarzany przez pijawkę lekarską; 65 aa, MW 7kDa Przykład produktu: Refludan (Lepirodin). Identyczny z naturalnym białkiem, z wyjątkiem wymiany Leu na Ile na N-końcu i brakiem reszty O-sulfonowej na Tyr63. Wytwarzanie – E. coli Tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) Proteaza serynowa zbudowana z 527 aa. Katalizuje reakcję przekształcenia plazminogenu w plazminę trawiącą skrzepy fibrynowe; 5 domen strukturalnych-F, P, EGF, K1, K2. Stosowana w leczeniu fibrynolitycznym ostrego zawału mięśnia sercowego Produkt: Alteplase, CHO

22. Białka terapeutyczne - przykłady Czynniki krzepliwości krwi i antykoagulanty • Reteplase • produkt inżynierii tPA- usunięte 3 domeny • 2 naturalne domeny tPA- domena katalityczna P i domena K2 zapewniająca specyficznośc rozpoznania fibryny • wytwarzana w E. coli • brak domen EGF i K1- wydłużony biologiczny okres półtrwania • brak domeny F1- redukuje powinowactwo do fibryny • brak glikozylacji (produkcja w E. coli) TNKase • wymiana reszt aminokwasów w trzech pozycjach: Thr103 na Asn (generowanie nowego miejsca glikozylacji), Asn117 na Gln (usuniecie miejsca glikozylacji), sekwencja 296-299 Lys-His-Arg-Arg wymieniona na Ala-Ala-Ala-Ala. • wykazuje przedłużony okres półtrwania, zwiększenie odporności na działanie PAI-1, naturalnego inhibitora tPA- • Wytwarzany przez CHO

23. Białka terapeutyczne - przykłady Interferony i cytokiny Glikoproteiny o wielkości 165 - 207 aa, wytwarzane przez ludzkie leukocyty, o działaniu immunomodulatorowym, antyproliferacyjnym i antywirusowym. Pięć podstawowych rodzajów: alfa, beta, gamma, omega i kappa, różniących się wielkością, sekwencja aminokwasową i specyficznością działania. Rekombinowane inteferony znajdują zastosowanie w leczeniu niektórych chorób nowotworowych, infekcji wirusowych oraz stwardnienia rozsianego Mechanizm działania: wiązanie ze specyficznymi receptorami na powierzchni komórek transdukcja sygnału za pośrednictwem tyrozynowoej kinazy bialkowej uruchomienie selektywnej ekspresji genów Producenci: E. coli, CHO. Także wersje PEGylowane

24. Białka terapeutyczne - przykłady Hormony Szereg ludzkich hormonów ma strukturę peptydową lub białkową. Należą do nich hormony tropowe podwzgórza i przysadki mózgowej, niektóre hormony trzustki (insulina, glukagon) i wątroby (czynnik wzrostowy insulino-podobny), Glukagon Polipeptyd, 29 aa. Produkty: GlucaGen (S. cerevisiae), Glucagon (E. coli) Ludzki hormon wzrostu - somatotropina Białko, 192 aa, MW 22kDa. Produkt: Protropin (Somatrem), E. coli, zawiera dodatkową resztę Met na N-końcu. Follitropina beta Bialko dimeryczne, glikoproteina. Dwa łańcuchy; 92 aa i 111 aa Produkt: Follistim, CHO Zastosowanie w leczeniu bezpłodności kobiet spowodowanej zaburzeniami jajeczkowania Insulina

25. Insulina Od 1922 insulina świńska. Problem – różnica w łańcuchu B: Ala30 zamiast Thr Częściowe rozwiązanie: humanizowana insulina świńska – semisynteza Obecnie od 1982 - insulina ludzka rekombinowana

26. Białka terapeutyczne rekombinowane I generacji Gensulin (BIOTON) Konstrukcja genu: sekwencja kodująca Peptyd B-dipeptyd-Peptyd A-peptyd nośnikowy Ekspresja w Escherichia coli Produkt:białko fuzyjne w ciałach inkluzyjnych Etapy izolacji wstępnej: rozbicie komórek, izolacja ciał inkluzyjnych, naturacja Półprodukt: prekursor z mostkami disiarczkowymi Obróbka: rozcięcie hydrolityczne – oddzielenie peptydu nośnikowego oraz przecięcie wiązania peptydowego pomiędzy dipeptydem a peptydem A Oczyszczanie: chromatografia kolumnowa Dalsza obróbka: usunięcie dipeptydu przy użyciu karboksypeptydazy Produkt: insulina identyczna z ludzką, o czystości około 95% Dalsze oczyszczanie: HPLC, ekstrakcja, krystalizacja Produkt: insulina identyczna z ludzką, o czystości ponad 99,9%

27. Insuliny modyfikowane Lispro (Humalog) Zmiana w łańcuchu B: 28Pro-Lys29 28Lys-Pro29 Aspart (Novolog) Zmiana w łańcuchu B: 28Pro  28Asp Glargine (Lantus) Zmiana w łańcuchu A: 21Asn  21Gly Zmiana w łańcuchu B: dodanie 2 reszt Arg na C-końcu

28. Białka terapeutyczne - przykłady Enzymy - enzymy, których deficyt jest konsekwencją defektu genetycznego - enzymy jako terapeutyki (często pochodzenia innego niż ludzkie)

29. Białka terapeutyczne - przykłady Enzymy - Glukocerebrozydaza Glikoproteina, 497 aa, enzym lyzosomalny, hydrolizujacy glukocerebrozydy Deficyt glukocerebrozydazy – choroba Gauchera Produkt: Imiglucerase, CHO, w pozycji 495 His wymieniona na Arg, niekompletna glikozylacja – reszty mannozy jako końcowe cukry we fragmentach oligosacharydowych. Efekt: lepsze wiązanie do makrofagów Deoksyrybonukleaza I Glikoproteina, 260 aa, MW 37 kDa. Leczenie objawowe zwłóknienia torbielowatego Produkt: Pulmozyme, CHO Asparaginaza Enzym hydrolizujący asparaginę. Komórki białaczki nie mają zdolności biosyntezy asparaginy. Podanie asparaginazy chorym na białaczkę powoduje redukcję pozakomórkowej puli asparaginy a w efekcie selektywne zabicie komórek nowotworowych W leczeniu stosuje się asparaginazy produkowane przez E. coli lub Erwinia chrysantemi. Problem – immunogenność Produkt: Pegaspargase. PEGylowana L-asparaginaza z E. coli. Kowalencyjnie przyłaczony PEG 5 kDa. Znacząco zredukowana immunogenność

30. Metody wydłużania biologicznego okresu półtrwania białek terapeutycznych PEGylacja - przyłączanie kowalencyjne glikoli polietylenowych do białek terapeutycznych • dłuższy okres wchłaniania, • zmniejszenie procesu degradacji przez proteolizę • zmniejszenie antygenowości • zwiększenie stabilności termicznej i mechanicznej cząsteczki • dłuższa eliminacja z organizmu

31. Metody wydłużania biologicznego okresu półtrwania białek terapeutycznych • PEGylacja • Przykłady stosowanych leków modyfikowanych: • PEGylowana deaminanaza ( Adagen )- w terapii genetycznego niedoboru deaminazy adenozynowej • PEGylowana L-asparaginaza (Oncospar), w terapii białaczki limfoblastycznej • PEG- Intron (Pegintron- 2001) - w terapii chronicznego zapalenia wątroby typu C • Pegasys (2002) - w terapii chronicznego zapalenia wątroby typu C

32. Metody wydłużania biologicznego okresu półtrwania białek terapeutycznych • Białka fuzyjne - zawierają białko terapeutyczne • i białkowy fragment dodatkowy • zwiększenie masy cząsteczkowej leku powyżej progu nerkowego • wykorzystanie specyficznych właściwości przeciwciał • dla wzmocnienia ukierunkowanego działania leku • wyższa aktywność formy dimerycznej w porównaniu z monomeryczną

34. Enbrel: białko fuzyjne typu X –Fc powstałe przez połączenie zewnątrz- komórkowej domeny receptora TNF ( sTNF ) z rejonem Fc immunoglobuliny Rys. schemat immunoglobuliny 1-fragment wiążący antygen 2- region Fab 3- region Fc

35. Sposoby podawania leków białkowych Podawanie domięśniowe i podskórne Problem konieczności zapewnienia przedłużonego działania Polimery biokompatybilne, biodegradowalne, nieimmunogenne PLA – polimleczan PLGA – poli(D,L-mleczan-co-glikolan)

36. Sposoby podawania leków białkowych Implantowana pompa osmotyczna Przed implantacją system napełnia się roztworem leku. W miejscu implantacji woda przenika przez błonę do komory osmotycznej. Ilość roztworu leku wydzielanego ze zbiornika odpowiada ilości wody wchodzącej do komory Taki system zapewnia stały poziom leku białkowego w osoczu

37. Sposoby podawania leków białkowych Samoregulujący się system podawania insuliny

38. Sposoby podawania leków białkowych Podawanie doustne