Inleiding

1. Susceptibiliteitsbepaling van planktonische en sessieleBurkholderiacepacia complex cellenKatrien De Visschere

2. Inleiding • Burkholderia cepacia complex: • 17 nauw verwante species • Gram-negatieve bacteriën • Kunnen ernstige infecties veroorzaken bij mucoviscidosepatiënten • Behandeling moeilijk door grote resistentie • ≠ stammen vormen goed biofilms→ verhoogde resistentie

3. Inleiding • Mucoviscidose • Autosomaal recessieve aandoening • Ongeneeslijk • Secreties van kliercellen zijn minder vloeibaar→ o.a. problemen met luchtwegen en spijsvertering • Infectie met B. cepacia complex bacteriën:→ “cepacia syndroom”: dodelijk→ geleidelijk achteruitgang in longfunctie

4. Inleiding • Biofilms • Microbiële gemeenschap van sessiele cellen • Vastgehecht op een substraat, een oppervlak of aan elkaar • Ingebed in een extracellulaire matrix • Sessiele cellen vertonen in het algemeen een grotere resistentie tegen antimicrobiële agentia dan planktonische cellen

5. Onderzoek • Wat? • Gevoeligheid van planktonische cellen en sessiele cellen (biofilms) van 33 ≠Burkholderiacepacia complex stammen t.o.v. 6 ≠ antibiotica bepalen → ceftazidime, ciprofloxacine, meropenem, minocycline, tobramycine, trimethoprim-sulfamethoxazole (1-19) • Experimenten op “jonge” en “oude” culturen • Planktonische cellen • “Jonge” culturen: minimaal inhiberende concentratie (MIC) • “Oude” culturen: afdoding stationaire fase cultuur • Sessiele cellen • “Jonge” culturen: minimaal biofilminhiberende concentratie (MBIC) • “Oude” culturen: afdodingmaturebiofilm

6. Onderzoek • Waarom? • Vergelijken groei-inhibitie bij “jonge” planktonische cellen en biofilms door antibiotica • Vergelijken afdoding van planktonische cellen in de stationaire fase en mature biofilms door antibiotica

7. Methoden • “Jonge” planktonische cellen: • Verse reincultuur → kiemsuspensie (OD: 0,05) in MH 1x→ 50x verdunnen • Kuipjes van antibiotica-microtiterplaat (96 kuipjes, bodem: plat) vullen met MH 1x en verdunde kiemsuspensie • 20u incubatie (37°C) • Absorptie in elk kuipje meten met VICTOR2TM • Bepaling minimaal inhiberende concentratie (MIC) • Kuipjes zonder groei → 100µL uitplaten (strijkplaatmethode) • Na 48u incubatie (37°C): groei nagaan • Bepaling minimaal bactericide concentratie (MBC)

8. Methoden • “Jonge” biofilms: • Verse reincultuur → startsuspensie in MH 1x • Nacht incubatie in warmwaterbad (37°C) • Startsuspensie → werksuspensie (OD: 0,05) • Kuipjes van microtiterplaat (96 kuipjes, bodem: rond) vullen met MH 1x en werksuspensie (100µL) • 4u incubatie (37°C) • 3x spoelen met fysiologisch water • Kuipjes vullen met 100µL MH 2x • Antibiotica toevoegen (100µL)

9. Methoden • “Jonge” biofilms: • 20u incubatie (37°C) • Spoelen met fysiologisch water • CellTiterBlue toevoegen (detectie levende cellen) • 1u incubatie (37°C) • Fluorescentie meten met VICTOR2TM • Bepalen minimaal biofilm inhiberende concentratie (MBIC)

10. Methoden • Mature biofilms: • Verse reincultuur → kiemsuspensie in MH 1x • Nacht incubatie in warmwaterbad (37°C) • Kiemsuspensie → startsuspensie (OD: 0,05) • Siliconeschijfjes in microtiterplaat (24 kuipjes) brengen • Kuipjes vullen met MH 1x en startsuspensie • 4u incubatie (37°C) • 3x spoelen met fysiologisch water • Kuipjes vullen met MH 1x • 20u incubatie (37°C) • 3x spoelen met fysiologisch water

11. Methoden • Mature biofilms: • Overbrengen in antibiotica-microtiterplaat→concentraties antibiotica: 10 x MIC, tobramycine: 4 x MIC • 20u incubatie (37°C) • 3 x wassen met fysiologisch water • Schijfjes overbrengen in falconbuisjes • Buisjes 3 x vortexen en soniceren (cellen losmaken) • Kiemsuspensie wordt 7 maal 1:10 verdund • 1mL per verdunning uitplaten (plaatgietmethode) • Kolonies tellen na 48u incubatie • Bepalen reducties in log(KVE)/schijfje

12. Resultaten: MIC • MIC vs. de klinisch haalbare antibioticaconcentratie in het sputum van mucoviscidosepatiënten (KHCS)

13. Resultaten: MBC • Hoe verhoudt de MBC zich tot de MIC? • Grote spreiding MBC t.o.v. MIC → uitzondering: tobramycine (kleine spreiding)

14. MBIC vergeleken met MIC • Relatie MBIC vs. MIC: • De MBICs zijn vergelijkbaar met de MICs voor het grootste deel van de stammen

15. Reductie in aantal cellen bij maturebiofilms • De onderzochte antibiotica veroorzaken bij alle stammen reductie • Mate van reductie: vertoont een grote variatie • Tobramycine is het meest werkzame antibioticum → met een paar uitzonderingen • Mate van biofilmvorming ↑, cellen die overblijven na behandeling met antibiotica↑ B. pyrrocinia LMG 14191 B. multivorans LMG 13010 9,0 9,0 8,0 8,0 7,0 7,0 6,0 6,0 5,0 5,0 aantal cellen (log(KVE)/schijfje) aantal cellen (log(KVE)/schijfje) 4,0 4,0 3,0 3,0 2,0 2,0 1,0 1,0 0,0 0,0 TMP-SMX TMP-SMX minocycline minocycline ceftazidime ceftazidime tobramycine meropenem meropenem tobramycine groeicontrole groeicontrole ciprofloxacine ciprofloxacine

16. Conclusie • “Jonge culturen” • MIC: vergelijking met klinisch haalbare antibioticaconcentratie in het sputum van mucoviscidosepatiënten:  voor veel antibiotica is deze concentratie onvoldoende om groei-inhibitie te veroorzaken • MBC: variabel t.o.v. MIC (uitzondering: tobramycine) • MBIC: vergelijkbaar met MIC bijna alle MBICs liggen binnen de range [1/2 – 2] x MIC

17. Conclusie • “Oude” culturen • Reductie in aantal cellen bij maturebiofilms:→ vertoont een grote variatie→ tobramycine is het meest werkzame antibioticum→ mate van biofilmvorming ↑, cellen die overblijven na behandeling met antibiotica↑

18. Toekomstperspectieven • Experimenten op planktonische cellen in een stationaire fasecultuur moeten nog uitgevoerd worden: • Antibioticaconcentraties: 10 x MIC, behalve tobramycine: 4 x MIC

19. Met dank aan: • Prof. Nelis en Prof. Coenye • Apr. E. Peeters • Apr. B. Quartier

20. Zijn er nog vragen?