L.S. in Scienze e tecnologie alimentari Anno Accademico 2008/2009 Corso integrato:

1. L.S. in Scienze e tecnologie alimentari Anno Accademico 2008/2009 Corso integrato: Controllo delle modificazioni chimiche negli alimenti (7 CFU) Modulo di: Chimica analitica strumentale (4 CFU) Giorgio Bonaga CROMATOGRAFIA LIQUIDA (LC) (CAS-4c) Giorgio Bonaga

2. RICHIAMO DI CHIMICA AUTODISSOCIAZIONE DELL’ACQUA H3O+ -OH ? H2O H2O Giorgio Bonaga

3. peso acqua mol wt. 1 litro Nell’acqua pura è molto piccola la percentuale di molecole dissociate in ioni ossonio e ioni ossidrile, secondo l’equilibrio: H2O + H2O H3O+ + -OH A 25°C, la costante di equilibrio è espressa dalla: Kdis = = 1,8 . 10-16 Il valore della costante di equilibrio conferma che l’equilibrio è decisamente spostato verso sinistra, tanto che il termine relativo alla concentrazione dell’acqua all’equilibrio ([H2O] eq), - pari alla concentrazione iniziale dell’acqua ([H2O] iniz) meno la frazione x di molecole d’acqua che si dissociano ([H2O] iniz – x) - in realtà si può equiparare alla concentrazione iniziale dell’acqua ([H2O] eq = [H2O] iniz), perché l’approssimazione è ininfluente. Tenendo conto che la concentrazione iniziale di 1 litro di acqua pura è, a temperatura costante, una costante: [H2O] iniz = = = = 55,55 mol/litro [H3O+] . [-OH] [H2O] iniz 1000 g numero moli 18 volume 1 l Giorgio Bonaga

4. La Kdis può essere espressa da una nuova costante, detta prodotto ionico dell’acqua: • KW = = Kdis = 1,8 . 10-16 .55,55 = 10-14 • In considerazione del fatto che da ogni molecola d’acqua dissociata si produce uno ione ossonio e uno ione ossidrile, è ovvio che la concentrazione di queste due specie ioniche è la medesima: • Si può scrivere che: = KW = 10-7 grammo-ioni/l • A 25°C, in un litro d’acqua pura (volume costante) sono presenti 10-7 (1/10.000.000) grammo-ioni (grammo-moli) ossonio e 10-7 (1/10.000.000) grammo-ioni (grammo-moli) ossidrile • soluzione neutra • soluzione acida • soluzione basica • Essendo una reazione endotermica la dissociazione dell’acqua - nel rispetto del principio di Le Chatelier - aumenta all’aumentare della temperatura e pertanto la neutralità, a temperature superiori a 25°C, si raggiunge con concentrazioni degli ioni ossonio e ossidrile leggermente superiori a 10-7 grammo-moli/litro. .[H2O]iniz [H3O+] . [-OH] [H3O+] = [-OH] [H3O+] = [-OH] [H3O+] = [-OH] [H3O+] > [-OH] [H3O+] < [-OH] Giorgio Bonaga

5. pH e pOH (pH = pondus hydrogenii = potenziale dell’idrogeno) (pOH = pondus oxidrilii = potenziale dell’ossidrile) L’ordine di grandezza estremamente piccolo delle concentrazioni degli ioni ossonio ed ossidrile suggerisce l’introduzione di un operatore matematico che consenta una percezione immediata del carattere neutro, acido e basico delle soluzioni ed anche un calcolo più rapido nelle applicazioni quantitative di questi concetti. Questo operatore è il logaritmo negativo in base dieci (- log) che, come tutti i logaritmi, esprime “l’esponente da dare alla base per ottenere il numero”. Concettualmente l’introduzione del logaritmo capovolge l’obiettivo del calcolo matematico delle concentrazioni delle soluzioni. Infatti, se la simbologia [H3O+] = 10-6 indica che sono presento 10-6 grammo-ioni H3O+ in 1 litro di soluzione, il –log [H3O+] = pH = - log 10-6 = 6 individua invece l’esponente che bisogna dare alla base 10 per ottenere in quanti litri di soluzione è presente 1 grammo-ione H3O+, ovvero 106 litri. Il pH, pertanto, non definisce la concentrazione degli ioni ossonio della soluzione, ma invece la diluizione di una soluzione che contiene 1 grammo-ione di H3O+. Il discorso è del tutto analogo per il pOH. Giorgio Bonaga

6. Il cologaritmo in base dieci (-log) converte la concentrazione (volume costante e soluto variabile) in diluizione (soluto costante e volume variabile), ovvero esprime in quanti litri (diluizione) di acqua pura è presente 1 grammo-ione ossonio (o ossidrile) anziché quanti grammo-ioni di ossonio (o di ossidrile) sono presenti in 1 litro d’acqua pura (concentrazione) . 100 grammo-ione H3O+ in 10.000.000 (107) litri d’acqua pura (DILUIZIONE) 1/10.000.000 (10-7) grammo-ioni H3O+ in 100 litri d’acqua pura (CONCENTRAZIONE) - log 10-7 Giorgio Bonaga

7. 107 106 105 104 103 102 101 100 Giorgio Bonaga

8. Dal momento che nell’acqua pura [H3O+] = [-OH] = 10-7 è intuitivo che nell’acqua pura: pH = pOH = 7 ed anche che: pH + pOH = 14 da cui: pOH = 14 – pH e pH = 14 - pOH Dal concetto stesso di pH si può dedurre che esso varia nell’intervallo 0-14 per soluzioni 1N, ma anche che il pH può assumere valori inferiori a 0 e superiori a 14 in soluzioni di concentrazione > 1N ESEMPIO Qual è il pH di una soluzione 10 N di HCl ? Essendo l’HCl un acido forte completamente dissociato, la N della soluzione fornisce direttamente la concentrazione di ioni ossonio: [H3O+] = 10 = 101 pH = - log 101 = -1 (è presente un grammo-ione H3O+ in 10-1 litro = 1/10 litro = 100 ml) Giorgio Bonaga

9. Giorgio Bonaga

10. pka e pkb Per il calcolo del pH di soluzioni di acidi e basi deboli non è sufficiente conoscere la loro concentrazione iniziale, in quanto non sono completamente dissociati in soluzione acquosa. Per determinare quale concentrazione assumeranno gli ioni H3O+ (o -OH) è quindi necessario conoscere anche la loro costante di dissociazione. 1) Per un generico acido monoprotico HA, l'equilibrio di dissociazione è: HA + H2O H3O+ + A- La costante di equilibrio, detta costante di dissociazione acida (o kappa acida), è: ka = Analogamente al pH, anche la costante di dissociazione acida può essere convertita nella diluizione di ioni ossonio in soluzione, utilizzando il logaritmo negativo in base 10 della ka: pka = – log ka Più elevato è il valore del pka maggiore è la diluizione degli ioni ossonio, ovvero più elevato è il pka minore è la forza dell’acido. Giorgio Bonaga [H3O+] . [A-] [HA]

11. [H3O+] . [HSO3-] [H2SO3] [H3O+] . [SO3--] [HSO3-] Per gli acidi deboli poliprotici ci sono tante costanti di dissociazione quanti sono gli atomi di idrogeno dissociabili: costante di prima dissociazione (kaI), costante di seconda dissociazione (kaII) , ecc., dalle quali si possono calcolare le corrispondenti pkaI, pkaII, ecc. H2SO3 + H2O H3O+ + HSO3- kaI = = 1,54 . 10-2 HSO3- + H2O H3O+ + SO3--kaII = = 1,02 . 10-7 Naturalmente l'acido cede più facilmente il primo protone H+, mentre il secondo protone H+, che deve staccarsi da uno ione negativo, è trattenuto con maggiore forza. Il primo equilibrio di dissociazione è quindi più spostato verso destra del secondo. È questo un comportamento generale: tutti gli acidi deboli poliprotici mostrano valori decrescenti delle ka successive alla prima e pertanto anche valori crescenti dei pka. Giorgio Bonaga

12. 2) Per una generica base monossidrilica BOH, l'equilibrio di dissociazione è: BOH B+ + - OH La costante di equilibrio, detta costante di dissociazione basica (o kappa basica), è: kb = Anche la costante di dissociazione basica può essere convertita nella diluizione di ioni ossidrile in soluzione, utilizzando il logaritmo negativo in base 10 della kb: pkb = – log kb Più elevato è il valore del pkb maggiore è la diluizione degli ioni ossidrile, ovvero più elevato è il pkb minore è la forza della base. [B+] . [-OH] [BOH] Per le basi deboli poliossidriliche ci sono tante costanti di dissociazione quanti sono gli ossidrili dissociabili: costante di prima dissociazione (kbI), costante di seconda dissociazione (kbII) , ecc., dalle quali si possono calcolare le corrispondenti pkbI, pkbII, ecc. Naturalmente la base cede più facilmente il primo ossidrile -OH, mentre il secondo ossidrile -OH, che deve staccarsi da uno ione positivo, è trattenuto con maggiore forza. È questo un comportamento generale: tutti le basi deboli poliossidriliche mostrano valori decrescenti delle kb successive alla prima e pertanto anche valori crescenti dei pkb. Giorgio Bonaga

13. C) CROMATOGRAFIA IONICA 1) CROMATOGRAFIA DI SCAMBIO IONICO (Ion Exchange Chromatography = IEC) 1. GENERALITA’ È idonea alla separazione di composti ionici o ionizzabili (acidi e basi organiche) che possono interagire con gruppi ionici. FASE STAZIONARIA: polimeri o silice funzionalizzata a cui sono legati gruppi carichi: anioni sulfonil- (-SO3-) o carbossil- (–COO-) come scambiatori di cationi; cationi dialchilammino- (-NHR2+) o trialchilammino- (-NR3+) come scambiatori di anioni. FASE MOBILE: contiene un controione di carica opposta al gruppo ionico della superficie, in uno stato di equilibrio per effetto della formazione di una coppia ionica. Lo scambio dipende dal pH della fase mobile, dalla forza ionica (selettività) degli ioni fissati sulla fase stazionaria e dalla forza ionica dello ione della fase mobile che con essi si scambia, dall’attività (concentrazione) dello ione della fase mobile, dalla temperatura. Giorgio Bonaga

14. SCAMBIATORE CATIONICO: anioni sulfonil- H+ K+ Li+ Rb+ Na+ Giorgio Bonaga

15. +Na O O O S S S O- O- O- O O O CROMATOGRAFIA LIQUIDA DI SCAMBIO IONICO Scambio cationico +Cs fase mobile (ionica) +K +Cs Si + Si Si fase stazionaria silice scambiatrice (anionica) Giorgio Bonaga

16. SCAMBIATORE ANIONICO: cationi trimetilammino- HO- Cl- Giorgio Bonaga

17. CROMATOGRAFIA LIQUIDA DI SCAMBIO IONICO Scambio anionico -OH R R R N+ N+ N+ R R R R R R fase mobile (ionica) -Cl + Si Si -CN -CN Si fase stazionaria silice scambiatrice (cationica) Giorgio Bonaga

18. EQUILIBRI IONICI NELLA IEC scambio cationico X+(sol) + Y+ -O3S-FS X+ -O3S-FS + Y+(sol) Kd== k’ VM [X+ -O3S-FS] [Y+(sol)] [Y+ -O3S-FS] VS [X+(sol)] scambio anionico X-(sol) + Y- +NR3-FS X- +NR3-FS + Y-(sol) Kd== k’ VM [X- +NR3-FS] [Y-(sol)] [X-(sol)] [Y- +NR3-FS] VS La costante di equilibrio di distribuzione Kd (o coefficiente di distribuzione) determina il valore del fattore di capacità k’ di uno ione e quindi il suo tR. Giorgio Bonaga

19. ORDINE DI SELETTIVITA’ La Kd è condizionata dal tipo di scambiatore e dall’attitudine dei due ioni a scambiarsi. Per un particolare scambiatore entrano in gioco due fattori: lo ione che viene fissato il controione che viene spostato L’attitudine dei cationi e degli anioni ad essere fissati sui gruppi carichi della fase stazionaria è direttamente proporzionale al valore della loro Kd . Per i cationi e gli anioni si può indicare il rispettivo ordini di selettività: scambio cationico:Ba++>Ca++>Ni++>Cu++>Mg++>Ag+>Rb+>Cs+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+ E’ facile comprendere che Na+sposta Li+ dalla fase stazionaria, ma non viceversa. O meglio, affinchèLi+ sposti Na+ in modo significativo occorre aumentare l’attività (cioè la concentrazione ionica) di Li+ nella soluzione, in modo che l’equilibrio, per mantenere costante il valore della Kd, si sposti verso destra. scambio anionico:HSO4->ClO3->NO3->ClO2->ClO->Br->CN->HSO3->NO2->Cl->HCO3-> HCOO->RCOO->HO->F- Giorgio Bonaga

20. I fattori che intervengono nello scambio ionico sono: • la posizione nell’ordine di selettività dello ione da fissare nella fase stazionaria; • la posizione nell’ordine di selettività degli ioni da spostare nella fase mobile; • le attività (concentrazioni ioniche) dello ione da fissare e degli ioni da spostare; • lo ione della fase mobile deve occupare una posizione nell’ordine di selettività non troppo lontano da quelle degli ioni da spostare. • Dopo aver fissato sullo scambiatore Na+ e K+ si può eluire con una soluzione di Li+Cl- ad opportuna concentrazione. Avviene lo scambio ionico e i due ioni da separare eluiscono con tR differenti: tRK+ > tRNa+ (in base alla loro posizione nella scala di selettività). Dopo aver fissato sullo scambiatore Ni++ e Ba++, l’eluizione con una soluzione di Li+Cl- non riuscirebbe a separare i due ioni, perché sono troppo lontani da Li+ nella scala della selettività (bisognerebbe eluire con un grande volume di fase mobile e per un tempo lungo). In questo caso si deve usare una fase mobile dotata di maggiore capacità eluente, ad esempio MgCl2. Giorgio Bonaga

21. Giorgio Bonaga 2. FASE STAZIONARIA Vi sono vari tipi di fasi stazionarie: a) POLIMERI Sono resine ottenute da copolimeri reticolati di stirene-divinilbenzene (8%) sulle quali vengono fissati i gruppi ionogeni positivi e negativi. La reticolazione ha lo scopo di rendere il polimero insolubile nei solventi e di conferirgli una stabilità strutturale alle pressioni di esercizio della colonna, in modo da non restringere troppo la dimensione dei pori. Il diametro delle particelle non deve essere superiore a 10 mm per ottimizzare il diametro dei pori. b) SILICE Viene utilizzata silice porosa e silice pellicolare. b1) Silice porosa Costituita da particelle sferiche o irregolari, viene funzionalizzata per silanizzazione allo scopo di fissare le catene ionogene sui gruppi silanolici e sulla superficie dei pori. -CH2-CH2-COO - carbossietil- (debolmente acido) -CH2-CH2-SO3- sulfoniletil- (fortemente acido) scambio cationico

22. scambio anionico -CH2-CH2-NH3+ amminoetil- (debolmente basico) -CH2-CH2-N(CH3)3- trimetilamminoetil- (fortemente basico) b2) Silice pellicolare Costituita da particelle sferiche più grandi, viene funzionalizzata solo sulla superficie esterna allo scopo di fissare le catene ionogene soltanto sui gruppi silanolici. Giorgio Bonaga

23. La silice porosa è il materiale che consente le migliori separazioni perché riassume una serie di proprietà idonee a questo tipo di cromatografia: • ha una buona capacità di scambio; • è resistente alle elevate pressioni di esercizio; • ha elevata efficienza; • ha una buona capacità di rigenerazione; • ha però un limitato intervallo di pH di esercizio (2-8); • ha anche un costo elevato, sebbene inferiore a quello dei polimeri. • In ogni caso la porosità ideale è quella che non ritarda troppo lo scambio tra la fase stazionaria e la fase mobile all’interno dei pori, porosità che richiede particelle con un diametro non superiore a 10 mm. poro piccolo poro grande + + d = 10 mm + + + Giorgio Bonaga

24. 3. FASE MOBILE Le principali caratteristiche della fase mobile sono: a) EFFETTO TAMPONE Le specie ioniche che stanno alla base dello scambio ionico possono derivare da elettroliti forti (sostanze inorganiche) e da elettroliti deboli (sostanze organiche). L’acido acetico e l’acido formico, ad esempio, possono essere dissociati o no in funzione del pH. Proprio per garantire che i soluti siano nella forma ionica, la fase mobile deve contenere un componente con capacità tamponante. Naturalmente per lo scambio anionico la fase mobile deve avere valori elevati di pH, mentre per lo scambio cationico deve avere valori sufficientemente bassi di pH. In pratica, la fase mobile deve avere un pH di almeno una unità superiore al pka del soluto nello scambio anionico e di almeno una unità inferiore al pka del soluto nello scambio cationico. ESEMPIO acido acetico: pka = 4,75 la fase mobile deve avere pH = 5,75 ione ammonio: pka = 9,0 la fase mobile deve avere pH = 8,0 Giorgio Bonaga

25. Si immagini di dover separare il sistema CH3COOH/CH3COO- (pka=4,75) e HCOOH/HCOO- (pka=3,5) con uno scambiatore anionico. • a 4,75 < pH > 3,5 l’acido formico si dissocia e lo ione formiato viene trattenuto, mentre l’acido acetico, non dissociato, eluisce. • a pH > 7,0 entrambi gli acidi sono dissociati e vengono trattenuti in modo differente dalla fase stazionaria (l’acido formico è più trattenuto, in base alla scala di selettività) . • l’aumento di pH della fase mobile fa aumentare la dissociazione dei soluti nello scambioanionico, pertanto aumentano i loro tempi di ritenzione; la diminuzione di pHdella fase mobile produce l’effetto contrario • la diminuzione di pH della fase mobile fa aumentare la dissociazione dei soluti nelloscambio cationico, pertanto aumentano i loro tempi di ritenzione; l’aumentodi pHdella fase mobile produce l’effetto contrario • I tempi di ritenzione dei soluti sono inversamente proporzionali alla concentrazione della soluzione tampone perché se è vero che i soluti del tampone mantengono costante il pH della fase mobile, è anche vero che essi stessi sono degli ioni che entrano in competizione con i soluti nello scambio ionico. Nello scambio anionico è la concentrazione dell’anione del tampone ad essere competitivo, nello scambio cationico è competitivo il catione del tampone. Giorgio Bonaga

26. Quando il pH della fase mobile è minore di 2 o maggiore di 8, la silice non è più utilizzabile e bisogna ricorrere a fasi stazionarie costituite da polimeri. Il pH della fase mobile incide anche sulla scelta delle catene ionogene: mentre i gruppi sulfonile (-SO3-) possono dare scambio cationico anche a pH nettamente acido perché hanno scarsa attitudine a protonarsi, i gruppi carbossile (-COO-) danno scambio cationico soltanto a pH neutro o basico, proprio per la loro facilità a protonarsi. Giorgio Bonaga

27. Giorgio Bonaga

28. ammide pirrolo solfossido alifatico tiazolo ammina aromatica amminoacido acido carbossilico tiolo aromatico carbazolo tiolo alifatico fenolo ammina alifatica Giorgio Bonaga

29. b) EFFETTO DELLA CONCENTRAZIONE SALINA • Per modificare i tR dei soluti, senza modificare il pH della fase mobile, si può aggiungere un sale (es.: NaNO3). La concentrazione di questo sale, per effetto dell’azione competitiva degli ioni di cui è formato sullo scambio ionico, è un’altra variabile che agisce sui tR dei soluti. • l’aumento della concentrazione salina, a parità di pH, determina la diminuzione della capacità della fase stazionaria di trattenere i soluti, pertanto si ha una riduzione dei loro tR; • la diminuzione della concentrazione salina, a parità di pH, determina un aumento della capacità della fase stazionaria di trattenere i soluti, pertanto si ha una aumento dei loro tR. 20 10 Ritenzione relativa 5 0 0,1 0,5 1,0 Giorgio Bonaga NaNO3 (molarità)

30. R N+ R R a) EFFETTO DEI SOLVENTI ORGANICI NELLA FASE MOBILE L’aggiunta di solventi organici alla fase mobile non ha alcun effetto sui tR di cationi metallici e anioni inorganici, ma modifica sensibilmente i tR di cationi e anioni organici perché influenza le interazioni tra i soluti e la fase stazionaria e tra i soluti e la fase mobile. Uno scambiatore a base di silice funzionalizzata con tetralchilammonio, ad esempio, può dare sia scambio anionico che adsorbimento di molecole o ioni organici contenenti gruppi alchilici, per interazione idrofobica tra le catene alchiliche. Aggiungendo alla fase mobile un solvente organico le interazioni idrofobiche che stanno alla base dell’assorbimento vengono inibite. Si adsorbimento scambio anionico Si Giorgio Bonaga

31. 4. DETECTOR NELLA IEC a) RIVELATORI ELETTROCHIMICI Poiché lo scopo della cromatografia ionica è la separazione e la determinazione di specie ioniche, il rivelatore più idoneo è quello conduttometrico, che misura la conduttanza della soluzione effluente.Le più moderne celle conduttometriche, con acquisizione digitale, permettono un ampio intervallo operativo senza necessità di variare manualmente il range di lavoro, entro un intervallo dinamico di rivelazione conduttimetrica molto esteso (da 0,1 nanosecondi a 15 millisecondi). Il trattamento del segnale digitale, comandato da microprocessore, rileva automaticamente le concentrazioni alte e basse dei soluti nel corso dell'esecuzione della medesima serie. Un aspetto importante è l'accuratezza del controllo della temperatura, che si realizza con sistemi di controllo integrati della colonna e del rivelatore. La cella può essere riscaldata in modo indipendente dagli altri componenti del cromatografo tra 35° e 55°C, per assicurare la massima accuratezza nel controllo di temperatura, eliminando in questo modo qualunque deriva dovuta a variazioni ambientali di temperatura. In altri casi, per assicurare una temperatura omogenea durante l'intero corso dell'analisi, il rivelatore viene inserito nel vano portacolonna, termostatato da 30° a 60°C. Giorgio Bonaga

32. b) RIVELATORI SPETTROFOTOMETRICI In genere i cromatografi ionici possono essere configurati con un qualsiasi rivelatore ottico tra quelli messi a disposizione dal mercato. Ad esempio, uno spettrofotometro a diode array (DAD) a matrice di 1024 fotodiodi ad alta risoluzione, caratterizzato da basso rumore di fondo e bassa deriva oppure un rivelatore UV-VIS con lampade al deuterio e al tungsteno per operare nel range 190-800 nm. L'uso di questi rivelatori è utile nella rivelazione di specie con cromoforo nell'UV, come ad esempio il nitrato, ma soprattutto trovano applicazioni in metodi, anche ufficiali, che prevedono la derivatizzazione post-colonna. c) RIVELATORI MS Lo spettrometro di massa con ionizzazione a pressione atmosferica (Atmospheric Pressure Ionization = API) si è rivelato un insostituibile rivelatore per la cromatografia liquida in generale e per la cromatografia ionica in particolare, grazie alla capacità di risolvere problemi analitici non superabili con le tecniche di rivelazione elettrochimica o spettrofotometrica. Sono disponibili sul mercato sistemi dedicati IC-MS, gestiti con un unico software. L'uso della soppressione a membrana prima dell'interfaccia API permette di modificare il pH della soluzione da analizzare ottimizzando così la fase di ionizzazione per elettrospray. Giorgio Bonaga

33. La scelta dello spettrometro di massa come rivelatore per IC si basa sul principio di mettere a disposizione un rivelatore affidabile, robusto e di facile utilizzazione, anche per operatori non esperti. Per ottimizzare la sensibilità strumentale l’operatore deve agire solo su due parametri: • la temperatura del probe dell’elettrospray, in funzione del flusso e della composizione dell'eluente, ; • il potenziale della sorgente. • Un aumento del potenziale della sorgente produce una maggiore frammentazione delle molecole per effetto di collisioni indotte, generando frammenti diagnostici che aumentano la specificità dell'analisi e possono dare informazioni strutturali aggiuntive per l’identificazione dei soluti. • Dal punto di vista spettrometrico la caratteristica più importante è la possibilità di ottimizzare la risposta dell'analizzatore nell'intervallo di masse basse, tipiche degli ioni inorganici. Questa tecnica detta ELMO (Enhanced Low Mass Option) permette di estendere il “mass range” al di sotto di m/z 19, con un aumento della sensibilità di 350 volte per lo ione m/z 18 e con una limitata perdita di risposta alle masse più alte. Questa opzione si ottiene mediante una modifica dell'hardware, ovvero con l'introduzione di una lente RF esapolare da 5 mm e di due generatori di radiofrequenza separati. Giorgio Bonaga

34. SO3- - 0 7 3,0 9 6,0 9,0 12,0 min • IEC di un vino bianco (solfiti) • Colonna analitica: 200 mm x 4 mm i.d., IonPac AS12A • Precolonna: 50 mm x 4 mm i.d., IonPac AG12A • Elettrolita di trasporto: NaOH 0,1 M • Flusso: 1,0 ml/min • Sample Loop: 20 ml. Giorgio Bonaga

35. fenacetina caffeina acetanilide 0 7 5,0 10 min • IEC di un farmaco(analgesico, antinfiammatorio) • Colonna analitica: scambiatoreanionico • Fase mobile: acquosa a pH 5,5 • Rivelatore: UV a 254 nm Giorgio Bonaga

36. 2) CROMATOGRAFIA IONICA CON SOPPRESSIONE (Suppressed Ion Chromatography = SIC) 1. SOPPRESSIONE A COLONNA La colonna analitica viene collegata ad una seconda colonna (colonna di soppressione) che elimina il contributo alla conducibilità dovuto alla fase mobile (solventi, tampone, sali), così che la conducibilità sia soltanto quella dei soluti che sono stati separati, anche se presenti in piccole concentrazioni. • SOPPRESSIONE DI ANIONI • Se la fase mobile fosse costituita da NaOH (o NaHCO3), la fase stazionaria da una resina a scambio anionico e il campione da separare contenesse NaF, NaCl e NaBr, quali sarebbero i passaggi logici nella colonna analitica ? • 1. la colonna viene saturata con gli anioni –OH (o HCO3-) della fase mobile; • caricando il campione la resina scambia gli –OH con gli ioni F-, Cl- e Br-; • al passaggio della fase mobile (eluizione) gli ioni F-, Cl- e Br- si scambiano nuovamente con gli ioni –OH della fase mobile ed eluiscono in questo ordine, nel rispetto della scala di selettività; • all’uscita dalla colonna si ha la seguente composizione: • fase mobile: NaOH (o NaHCO3) • soluti separati: NaF, NaCl, NaBr Giorgio Bonaga

37. La composizione dell’eluato richiede alcune considerazioni: la concentrazione e la conducibilità della fase mobile (NaOH o NaHCO3) è molto elevata mentre le concentrazioni e le conducibilità dei soluti sono talmente basse che non produrrebbero variazioni significative dei segnali del detector, con enorme riduzione della sensibilità strumentale. Questo limite può essere superato collocando tra la colonna analitica e il detector una colonna a scambio cationico saturata di ioni H+ (HCl). Gli ioni H+ vengono scambiati con gli ioni Na+ sia perché sono meno trattenuti dalla fase stazionaria (in accordo con la scala di selettività), sia perché reagiscono con gli ioni –OH (o HCO3-) con formazione di H2O (o H2CO3 = H2O+CO2). All’uscita dalla colonna di soppressione si ha la seguente composizione: fase mobile: H2O (o H2O + CO2) soluti separati: HF, HCl, HBr Il risultato netto è che le nuove specie della fase mobile hanno una conducibilità minima, mentre le nuove specie dei soluti sono acidi con valori di “ka” che producono una conducibilità elevata. Naturalmente la colonna di soppressione si esaurisce e va rigenerata con una soluzione di HCl prima di essere reimpiegata. Giorgio Bonaga

38. b) SOPPRESSIONE DI CATIONI • Se la fase mobile fosse costituita da HCl (o H2SO4), la fase stazionaria da una resina a scambio cationico e il campione da separare contenesse LiCl, NaCl e KCl, quali sarebbero i passaggi logici nella colonna analitica ? • 1. la colonna viene saturata con gli anioni H + della fase mobile; • caricando il campione la resina scambia gli H+ con gli ioni Li+, Na-+e K+; • al passaggio della fase mobile (eluizione) gli ioni Li+, Na-+e K+ si scambiano nuovamente con gli ioni H+ della fase mobile ed eluiscono in questo ordine, nel rispetto della scala di selettività; • all’uscita dalla colonna si ha la seguente composizione: • fase mobile: HCl (o H2SO4) • soluti separati: LiCl, NaCl, KCl • La composizione dell’eluato richiede alcune considerazioni: la concentrazione e la conducibilità della fase mobile (HCl o H2SO4) è molto elevata mentre le concentrazioni e le conducibilità dei soluti sono talmente basse che non produrrebbero variazioni significative dei segnali del detector, con enorme riduzione della sensibilità strumentale. Giorgio Bonaga

39. Questo limite può essere superato collocando tra la colonna analitica e il detector una colonna a scambio anionico saturata di ioni –OH (NaOH). Gli ioni -OH vengono scambiati con gli ioni Cl- perché sono meno trattenuti dalla fase stazionaria (in accordo con la scala di selettività), sia perché reagiscono con gli ioni H+ con formazione di H2O. All’uscita dalla colonna di soppressione si ha la seguente composizione: fase mobile: H2O soluti separati: LiOH, NaOH, KOH Il risultato netto è che le nuove specie della fase mobile hanno una conducibilità minima, mentre le nuove specie dei soluti sono basi con valori di “kb” che producono una conducibilità elevata. Naturalmente la colonna di soppressione si esaurisce e va rigenerata con una soluzione di NaOH prima di essere reimpiegata. Nel caso della cromatografia ionica di metalli di transizione la soppressione produce degli idrossidi non dissociati o insolubili [Ni(OH)2, Cu(OH)2, ecc.] e pertanto anziché un detector conduttometrico si utilizza un rivelatore spettrofotometrico, previo trattamento della soluzione del campione - prima dell’eluizione in colonna analitica - con un indicatore metallocromico [ad es.: sale monosodico del 4-(2-piridilazo) resorcinolo o PAR] in grado di formare i cromofori necessari alla rivelazione UV-VIS. PAR Giorgio Bonaga

40. SOPPRESSORE A COLONNA fase mobile campione pompa colonna analitica colonna di soppressione cella conducimetrica Giorgio Bonaga

41. 2. SOPPRESSIONE A FIBRA CAVA Il limite della colonna di soppressione è che si esaurisce e la sua rigenerazione non consente un processo in continuo. Un’alternativa è la soppressione a fibra cava, cioè una fibra cilindrica nel cui canale interno passa la soluzione eluente proveniente dalla colonna analitica e all’esterno, in controcorrente, viene fatta fluire la soluzione che deve provvedere alla soppressione degli ioni della fase mobile. a) SOPPRESSIONE DI ANIONI La fibra è permeabile ai cationi Na+ (in uscita) della fase mobile NaOH e H+ (in entrata) della soluzione di soppressione di HCl. Il risultato netto è la conversione degli ioni –OH della fase mobile in H2O e dei soluti NaF, NaCl e NaBr nei corrispondenti acidi HF, HCl e HBr. b) SOPPRESSIONE DI CATIONI La fibra è permeabile agli anioni Cl- (in uscita) della fase mobile HCl e -OH (in entrata) della soluzione di soppressione di NaOH. Il risultato netto è la conversione degli ioni +H della fase mobile in H2O e dei soluti LiCl, NaCl e KCl nei corrispondenti idrossidi LiOH, NaOH e KOH. Il limite della fibra cava è la limitata superficie della fibra, dovuta al fatto che per evitare l’allargamento dei picchi il diametro del canale interno dev’essere ridotto. Giorgio Bonaga

42. FIBRA CAVA eluente canale interno della fibra fibra permeabile a cationi o anioni scambio cationico o scambio anionico scambio cationico o scambio anionico soluzione di soppressione soluzione di soppressione Giorgio Bonaga

43. SOPPRESSORE A FIBRA - ANIONI F - Cl - Br - NaBr NaCl NaOH NaF Na+ Cl - Na+ Cl - NaOH NaOH Cl – Cl – NaOH NaOH Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ -OH -OH -OH -OH H2O H2O Cl - H+ Cl - H+ H2O H2O HBr HCl H2O HF H+ Cl - H+ Cl - Giorgio Bonaga

44. SOPPRESSORE A FIBRA - CATIONI Li+ Na+ K+ KCl NaCl HCl LiCl Na+ Cl - Na+ Cl - HCl HCl Na+ Na+ HCl HCl Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - -OH -OH -OH -OH -OH -OH H+ H+ H+ H+ H2O H2O -OH Na+ -OH Na+ H2O H2O KOH NaOH H2O LiOH Na+ -OH Na+ -OH Giorgio Bonaga

45. c) SOPPRESSIONE A MEMBRANA È una soppressione che opera secondo gli stessi principi del soppressore a fibra cava, ma la permeabilità ai cationi o agli anioni è dovuta ad una membrana semipermeabile. Il soppressore a membrana è costituito da una camera laminare con tre schermi metallici scambiatori alternati con due membrane di scambio (struttura a “sandwich”). Il soppressore a membrana non soltanto consente di operare in continuo, ma la maggiore superficie di contatto tra la soluzione di soppressione e la soluzione eluente, consente una soppressione più completa. schermo scambiatore membrana di scambio ionico Giorgio Bonaga

46. SOPPRESSORE A MEMBRANA soppressore HCl Na+Cl - flusso eluente HBr HCl H2OHF NaBr NaCl NaOHNaF COLONNA DETECTOR Na+ H+ H+ Na+ ELETTRODO Giorgio Bonaga

47. SO4- - formico lattico acetico malonico maleico propionico 0 79 8 16 min SIC di acidi organici liberi Giorgio Bonaga

48. Ala Val Leu Thr Ser Phe Glu Asp Arg Ile Met Lys Gly Tyr His Cys 0 7 30 9 60 min SIC di amminoacidi liberi di un mangime Giorgio Bonaga

49. Giorgio Bonaga 3) CROMATOGRAFIA DI COPPIA IONICA (Ion Pair Chromatography = IPC) È una tecnica cromatografica nella quale viene soppressa la ionizzazione di soluti ionizzabili e le specie che si ottengono, dotate di carattere lipofilo, vengono separate su fase inversa. 1. PREMESSA Se un soluto con proprietà ioniche (elettrolita debole) viene eluito con una opportuna fase mobile, produce un picco cromatografico caratteristico, in funzione del pH della fase mobile, come risultato del suo equilibrio di protonazione. La prima frazione del soluto che eluisce è quella ionizzata, dunque poco trattenuta dalla fase inversa (non polare), mentre la seconda frazione è quella indissociata, affine alla fase inversa. Nel caso di un acido carbossilico: R-COOH R-COO- + H+ a pH basico: prevale R-COO - il picco ha un tR molto basso a pH acido (< pka): prevale R-COOH il picco ha un tR più alto pH basico pH acido

50. Il risultato netto è un picco molto allargato e non risolto. Per evitare la formazione di specie indesiderate nella separazione di elettroliti deboli si può utilizzare un tampone che stabilizza il pH di esercizio. Naturalmente nel caso di elettroliti forti non soltanto il tampone non funziona, ma non si può neppure abbassare o alzare il pH della fase mobile fuori dall’intervallo di pH (2-8) entro il quale la silice funzionalizzata è stabile. 2. TECNICA IPC Il problema si può risolvere aggiungendo alla fase mobile un elettrolita costituito da uno ione (accoppiatore ionico) di dimensioni sufficientemente grandi e con carica opposta allo ione che si vuole “sopprimere”. Dal momento che il solvente organico della fase mobile produce un abbassamento della costante dielettrica, ci sono le condizioni affinché si formi una coppia ionica che, in un certo senso, si comporta come un soluto indissociato. R-COO- R-COOH tR Giorgio Bonaga