Patch Clamp Tekniği

1. Patch Clamp Tekniği Doç.Dr. Ülkü Çömelekoğlu

2. Nedir Patch Clamp ? • Büyük hücrelerden bir tek iyon kanal aktivitesinin küçük hücrelerden ise toplam zar akımının ölçülmesi yöntemidir.

3. Nereden nereye geldik?

4. 1780-1940 dönemi • Sinir ve kas gibi hücrelerde elektriksel akımın varlığı (Galvani 1786) • Canlı organizmaların hücrelerden oluştuğu (Schleiden ve Schwann 1850). • Sinir sisteminde nöronların varlığı ( Ramon Cajal 19. Yüzyıl sonu)

5. Sinir ve kas hücrelerinin sistematik olarak uyarılması ve yanıtlarının incelenmesi (19 yüzyıl sonları) • Bu yanıtları fizikokimyasal terimlerle yorumlanması ( Bernstein)

6. Galvonometrenin (20. Yüzyıl başı) • Vakum tüplü amplifikatörün ve katot ışınlı osiloskopun geliştirilmesi (Birinci dünya savaşından sonra) • Ve hücre dışından aksiyon potansiyeli kaydının yolunun açılması

7. 1940-1950 yılları • Hücre içi kayıt • Voltaj klamp tekniği • Matematiksel modeller

8. Hücre içi kayıtlar • Mürekkep balığı dev aksonunda ilk hücre içi kayıtlar

9. Ling ve Gerard (1949) • İlk intrasellüler sinyal kaydı • Nastuk ve Hodgkin (1950) • İlk intrasellüler aksiyon potansiyeli kaydı • Fatz ve Katz (1951) • İlk nöromüsküler kavşakta elektriksel aktivite kaydı.

10. Voltaj klamp • Toplam zar akımının kaydedilmesi • Zar akımının bileşenlerine ayrılması • Voltaj bağımlı kanallar düşüncesinin oluşması

11. Patch Clamp (1976 ve sonrası) • 1976 yılında enzimatik olarak yüzeyi temizlenmiş kurbağa kas hücre zarınının küçük bir parçası Neher ve Sakmann tarafından izole edilmiş ve pipet ucundaki zar parçasında asetilkolin ile aktive olan iyon kanalı akımları gözlenmiştir

12. Daha kaliteli ve ayırdedilebilir akımlar 1981 de pipet ucunun temiz, pürüzsüz olması ve emme uygulanması ile sağlanmıştır.

13. Neden Patch Clamp? • Canlı sistemde hücrelerarasında bilgi iletimi aksiyon potansiyeli adını verdiğimiz elektriksel sinyallerle sağlanır.

14. Elektriksel sinyallerin oluşabilmesi için zarın iki tarafında bulunan iyonların büyük bölümü hücre zarına gömülü bulunan iyon kanallarından geçmesi gerekir.

15. Bu nedenle iyon kanalları canlının sağlıklı bir yaşam sürmesi açısından büyük önem taşır

16. İyon kanallarının yapı ve işlevlerinde oluşacak değişiklikler iyon kanal hastalıkları olarak tanımlanan hastalıkların ortaya çıkmasına neden olur.

17. İyon kanal hastalıklarının nedenleri • Kanal proteinindeki mutasyonlar • Regülatör moleküllerdeki mutasyonlar • Kanal proteinlerine karşı oluşan antikorlar • Toksinler

18. İyon kanal akımlarının kaydedilmesi iyon kanallarının normal kinetik özelliklerinin ve iyon kanal hastalıklarının mekanizmalarının anlaşılması açısından günümüzde biyoelektriksel açıdan en ileri adımdır.

19. Şimdi Patch Clamp Yöntemini Daha Yakından Tanıyalım

20. Hücre zarındaki iyon kanallarının özellikleri ile ilgili bilgimiz büyük ölçüde voltaj klamp yöntemi sayesinde olmuştur. Yöntem kabaca hücre zarından iyon geçişlerini elektriksel akım olarak ölçmemizi sağlar.

21. Patch-clamp voltaj klamp yönteminin geliştirilmiş bir uygulamasıdır ve tek kanaldan geçen akımların kayıtlanmasını sağlar.

22. Bu yöntemde pipet ucu ile zar arasında çok sıkı bir yapışma sağlama (sealing), elektrofizyoloji alanında bir çığır açmış ve zarın elektriksel özellikleri çok hızlı biçimde ortaya çıkmıştır.

23. Patch-clamp düzeneğinin kurulması biraz pahalı bir yöntemdir. Ancak uygulama sırasında masraflarının az olması önemli bir avantajdır.

24. Patch-Clamp Konfigürasyonları • Amaca uygun olarak farklı konfigürasyonlar oluşturulabilir. Genel olarak kullanılan dört farklı patch clamp tekniği vardır

25. 1. Hücre üzerinde (Cell-Attached) • 2. İçi dışarıda • (İnside-out) • 3. Dışı-dışarıda • (outside-out) • 4. Tüm hücre • (Whole-cell)

26. Hücre üzerinde (Cell-attached) • Pipetle yakalanan hücre zarı yamasından geçen akımın kaydedilmesidir. • En basit kayıt biçimidir. • Pipet içine hücre dışı sıvısı konur. • Bu kayıt biçimi izole zar parçasından 2.haberci aracılı hormon nörotransmitter etkisini göstermek için kullanır. • En büyük avantajı sitoplazmik ortamı doğal şartlarda korumasıdır.

27. İnside-Out (İçi-dışarıda) • Yapışmadan sonra pipet geri çekilirse yama pipetin ucunda kalacak şekilde zardan ayrılır. • Yamanın sitoplazmik yüzü banyo ortamına temas eder, zarın dış yüzü ise pipet içine bakar. • Kanalların sitoplazmik yüzüne yaklaşma bu kayıt biçiminin en önemli özelliğidir.

28. Tüm Hücre (Whole-Cell) • Pipetle hücreye sıkı yapışıklık sağladıktan sonra, pipete emme uygulanarak tutulan yama yırtılır ve tüm hücrenin toplam zar akımı kaydedilir. • Tek kanal iletkenliği ölçülemeyecek kadar küçük olan veya hücre zarında seyrek olarak bulunan kanallarla ilgili bilgileri edinmek için kullanılır.

29. Dışı dışarıda (Outside-out) • Whole-cell’den sonra pipet yavaşça geri çekilir ve zar parçası koparılır. Zar parçasının uçları kapanır, pipet ucunda bir vezikül elde edilir. • Zar dış yüzüne iyon veya ligand uygulamaları için kullanılır.

30. Düzenek • Mikropipet ve elektrotlar • Patch-Clamp Amplifikatörü • İnvert Mikroskop • Mikromanuplatör • Kayıt ve analiz araçları • Vibrasyon önleyici masa • Faraday Kafesi • Hücre