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Mobilità di Proteine via NMR

Mobilità di Proteine via NMR. t c. Moti Molecolari. r. Scambio di H 2 O. Misure NMRD. Cambiamenti Conformazionali. Moti Catene Laterali. Esperimenti CPMG e T 1 . Moti Veloci. Strutturata/Destrutturata. 3. 0. -3. -12. -9. -15. -6. Simulazioni DM. N H. N D. NOE eteronuclear

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Mobilità di Proteine via NMR

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Presentation Transcript

  1. Mobilità di Proteine via NMR

  2. tc Moti Molecolari r Scambio di H2O Misure NMRD Cambiamenti Conformazionali Moti Catene Laterali Esperimenti CPMG e T1 Moti Veloci Strutturata/Destrutturata 3 0 -3 -12 -9 -15 -6 Simulazioni DM NH ND NOE eteronuclear Rilassamento T1 e T2. Velocità di Scambio Fenomeni Proteine e Scale di Tempo log(time/s)

  3. Rilassamento Il rilassamento è il processo con cui, un sistema che è stato eccitato (oppure ha subito una perturbazione) va di nuovo ad equilibrio...

  4. Le interazioni, dovute a mobilità, che possono creare campi magnetici oscillanti sul nucleo 15N sono: • Interazione Dipolare 1H-15N. • 15N CSA (Chemical Shift Anisotropy). • Altri: Quadrupolare, scalare... Rilassamento 15N Il rilassamento è causato dai campi magnetici oscillanti percepiti dal nucleo.

  5. In una proteina isotopicamente arricchita in 15N, ogni spin 15N è vicino sia a spin 1H che 15N. Poiché l’interazione si esercita attraverso r-3, e poiché per ogni 15N lo spin di gran lunga piu’ vicino è il suo HN ammidico, l’interazione diopolare H, HN è preponderante rispetto a tutte le altre interazioni dipolari, che possono essere in prima approssimazione trascurate.

  6. Quando una proteina in soluzione ruota, ciascun spin sente tutti gli altri come un campo fluttuante, che per effetto della rotazione della molecola si ri-orienta in continuazione rispetto allo spin studiato, creando quindi un campo magnetico oscillante

  7. Campi Magnetici Oscillanti

  8. B0 H I S N Interazione Dipolare 1H-15N La rotazionedella molecola in soluzione genera dei campi magnetici oscillanti intorno al nucleo. Questi campi forniscono un meccanismo di rilassamento al núcleo.

  9. Anisotropia dello Spostamento Chimico (CSA)

  10. Interazione 15N-CSA Beff= (1-) Bo Bo  =schermatura e-  zz X Se la distribuzione della carica elettronica è anisotropa, la schermatura sarà anisotropa. In soluzione si ottiene un valore promedio dovuto alla barillatura molecolare veloce: xx y y  = (xx + yy + zz)/3 CSA: La rotazione molecolare genera campi magnetici oscillanti che rapressentano un meccanismo di rilassamento per il nucleo osservato.

  11. Velocità di Rilassamento 15N in Proteine Se il rilassamento di ogni 15N amidico è determinato essenzialmente dall’accoppiamento dipolare H-N e dalla anisotropia dello Spostamento Chimico di 15N, ALLORA, le velocità di rilassamento di 15N dovrebbero essere uguali per tutti gli n 15N amidici di una catena polipeptidica di n aminoacidi. O C Distanza di legame 1.02Å Uguale per tutti H N Struttura elettronica intorno a N Ca Ha Uguale per tutti

  12. Funzione di Correlazione La Funzione di Correlazione, C(t), definisce il tempo che impiega un sistema per reorientarsi. Per una sfera rigida, C(t) si caratterizza per il Tempo di Correlazione.

  13. Tempo di Correlazione C (t) tempo (ns) Il Tempo di Correlazione, tc, è la costante di tempo per il decadimento esponenziale della Funzione di Correlazione. tc corti fanno diminuire rapidamente C(t).

  14. Funzione di Densità Spettrale J(w)/10-9 FT Frequenze (MHz) La Funzione di Densità Spettrale, J(w), rappresenta la distribuzione di frequenze generata per le oscillazioni del sistema. Spiega il moto aleatorio. tc lunghi corrispondono ad alte densità spettrali in un intervallo stretto di frequenze.

  15. Velocità di Rilassamento 15N e Meccanismi Le velocità di rilassamento derivano dalla somme di tutte le densità spettrali. Nel caso di 15N esse dipendono da 3 frequenze tipiche del sistema (0, wN, wH). J(0), J(wN), J(wH) Intervengono su R1 ed R2 ma anche sul NOE eteronucleare tra 1H e 15N. MisurandoR1, R2 ed NOE, io ho 3 equazioni dalla cui analisi posso ricavare il valore esatto del tc

  16. Equazione Stokes-Einstein Il Tempo di Correlazione, t, corrisponde al Tempo Rotazionale Browniano, tr, de molecule in soluzione seccondo l’equazione di Stokes-Einstein. • T: Temperatura. • r: Radio della Proteina. • h: Viscosità del Solvente.

  17. Sito II Sito I N-terminal C-terminal tc non è lo stesso per Tutti tc=4.5 ns tc=10.4 ns

  18. Velocità di Rilassamento 15N e Meccanismi Le velocità di rilassamento derivano dalla somme di tutte le densità spettrali. Nel caso di 15N esse dipendono da 3 frequenze tipiche del sistema (0, wN, wH). J(0), J(wN), J(wH) Intervengono su R1 ed R2 ma anche sul NOE eteronucleare tra 1H e 15N. MisurandoR1, R2 ed NOE, io ho 3 equazioni dalla cui analisi posso ricavare il valore esatto del tc

  19. B0 H I S N Interazione Dipolare 1H-15N La rotazionedella molecola in soluzione genera dei campi magnetici oscillanti intorno al nucleo. Questi campi forniscono un meccanismo di rilassamento al núcleo.

  20. Interazione 15N-CSA Beff= (1-) Bo Bo  =schermatura e-  zz X Se la distribuzione della carica elettronica è anisotropa, la schermatura sarà anisotropa. In soluzione si ottiene un valore promedio dovuto alla barillatura molecolare veloce: xx y y  = (xx + yy + zz)/3 CSA: La rotazione molecolare genera campi magnetici oscillanti che rapressentano un meccanismo di rilassamento per il nucleo osservato.

  21. 100 110 ) m p p ( N 120 5 1 d 130 12 11 10 9 8 7 6 5 d 1 H (ppm) Misura della Velocità di Rilassamento 15N

  22. Velocità di Rilassamento 15N in Calbindin D9K A B C

  23. 1.6 50 1.4 40 ) ) 1.2 1 1 - s 30 - s ( ( 1 2 R 1 R 20 0.8 10 0.6 0 0.4 0 20 40 60 80 100 120 140 0 20 40 60 80 100 120 140 1.6 1.2 E O 0.8 N N 5 0.4 1 - H 1 0 -0.4 0 20 40 60 80 100 120 140 Número de Residuo Velocità di Rilassamento 15N in Rusticianina A B C

  24. Velocità di Rilassamento 15N in Citocromo b5 Ossidato R2 R1 NOE

  25. Moti in Scala ns-ps del Citocromo b5 (Fe3+) Aumenta Mobilità

  26. Moti in Scala ns-ps del Citocromo b5 (Fe2+) Aumenta Mobilità

  27. Model Free J(w) tm • S:Parametro di Ordine • t’e:Tempo di Correlazione Effetivo • tm:Tempo di Correlazione Rotazionale • te:Tempo di Correlazione per Moti Interni • Se S2 < 1 c’è mobilità locale • Se S2 = 1 è rigido rispetto al sistema molecolare x S2 t’e x (1-S2) log(w) Lipari and Szabo, JACS 1982

  28. Oscillazioni in un Cono te D|| 1-S2 q Rex Il Parametro di Ordine S2 viene dato da: D S2 = [cosq(1+cosq) / 2]2 tr

  29. Oscillazioni in un Cono Le Velocità di Rilassamento R1 e R2 si analizzano via el metodo Model Free per ottenere informazione sui moti interni che avvengono a scale di tempi inferiori a ns e pure sulla rotazione molecolare.

  30. Parametro di Ordine in Calbindin D9K

  31. 2 S 0 20 40 60 80 100 120 140 Numero di Residuo Parametro di Ordine in Rusticianina

  32. Moti Interni a Diverse Scale di Tempo te (s) Rex (s-1) Numero di Residuo

  33. tc Moti Molecolari r Scambio di H2O Misure NMRD Cambiamenti Conformazionali Moti Catene Laterali Esperimenti CPMG e T1 Moti Veloci Strutturata/Destrutturata 3 0 -3 -12 -9 -15 -6 Simulazioni DM NH ND NOE eteronuclear Rilassamento T1 e T2. Velocità di Scambio Fenomeni Proteine e Scale di Tempo log(time/s)

  34. T2=80ms 180°y 180°y 90°x t t t t n M(t)=M0[e- D /T2] D=2t, 4t, 6t…. Misura di R2CPMG tè tipicamente tra 0,5 e 2ms. Se variando t si ottiene un valore diverso per R2, significa che c’è un fenomeno di scambio che agisce su una scala di tempo dell’ordine di t

  35. T2=80ms 180°y 180°y 90°x t t t t n M(t)=M0[e- D /T2] D=2t, 4t, 6t…. Misura di R2CPMG R2= R2+ Rexc Se ci sono dei valori di R2 che non sono interpretabili semplicemente ricorrendo alla analisi del model free, allora siamo in presenza di uno scambio più lento rispetto alla scala del tr

  36. GdmHCl 0 M GdmHCl 2 M R2(s-1) R2(s-1) Residue Number R2(1/tcp) in Ca2Cb • Mobilità ms-ms. • Andamento Simile. • Nessun Cambiamento nel Cuore.

  37. tc Moti Molecolari r Scambio di H2O Misure NMRD Cambiamenti Conformazionali Moti Catene Laterali Esperimenti CPMG e T1 Moti Veloci Strutturata/Destrutturata 3 0 -3 -12 -9 -15 -6 Simulazioni DM NH ND NOE eteronuclear Rilassamento T1 e T2. Velocità di Scambio Fenomeni Proteine e Scale di Tempo log(time/s)

  38. 100 100 100 3.5 M 0 M 2 M 110 110 110 ) m p p ( N 120 120 120 5 1 d 130 130 130 12 11 10 9 8 7 6 5 12 11 10 9 8 7 6 5 12 11 10 9 8 7 6 5 d 1 H d 1 H (ppm) (ppm) d 1 H (ppm) Destrutturazione di Apo-Cb

  39. tc Moti Molecolari r Scambio di H2O Misure NMRD Cambiamenti Conformazionali Moti Catene Laterali Esperimenti CPMG e T1 Moti Veloci Strutturata/Destrutturata 3 0 -3 -12 -9 -15 -6 Simulazioni DM NH ND NOE eteronuclear Rilassamento T1 e T2. Velocità di Scambio Fenomeni Proteine e Scale di Tempo log(time/s)

  40. Scambio HN-Solvente

  41. tc Moti Molecolari r Scambio di H2O Misure NMRD Cambiamenti Conformazionali Moti Catene Laterali Esperimenti CPMG e T1 Moti Veloci Strutturata/Destrutturata 3 0 -3 -12 -9 -15 -6 Simulazioni DM NH ND NOE eteronuclear Rilassamento T1 e T2. Velocità di Scambio Fenomeni Proteine e Scale di Tempo log(time/s)

  42. 100 100 cleanex phogsy 110 110 ) m p p ( N 120 120 5 1 d 130 130 12 11 10 9 8 7 6 5 12 11 10 9 8 7 6 5 d 1 H d 1 H (ppm) (ppm) H2O Strutturale

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