Reproductive Biology and Endocrinology 2008, 6:4

1. Reproductive Biology and Endocrinology 2008, 6:4 Effects of estradiol and FSH on maturation of the testis in the hypogonadal (hpg) mouseEfectos de estradiol y FSH en la maduración testicular en ratones hipogonadales Helen Baines, Margaret O Nwagwu, Graham R Hastie, Roman A Wiles, Terry M Mayhew and Francis JP Ebling

2. Histología testicular

3. El eje hipotálamo-hipofisario. Regulación de la espermatogénesis en mamíferos

4. Sin embargo… • Mutantes para aromatasa o ERαpresentan baja fertilidad y espermatogénesis anormal. • Estradiol normalmente inhibe producción de FSH en machos por feedbackneg. Pero el tratamiento crónico de ratones hpg con estradiol induce síntesis y secreción de FSH  maduración testicular, espermatogénesis cualitativamente normal. Evidencia del rol de los estrógenos en la espermatogénesis

5. Objetivo del trabajo: Determinar si los efectos causados por el estradiol en la espermatogénesis de ratones hpg son efectos directos en los testículos, o acciones indirectas vía estimulación de la secreción de FSH de la adenohipófisis. Hipótesis: Si la acción combinada de estradiol y FSH prueba ser mas efectiva que cualquiera de los tratamientos solos (efecto sinérgico), se puede concluir que estas hormonas actúan separadamente. Si la acción combinada es tan eficiente como dosis mas altas de FSH (efecto aditivo), entonces se concluye que el estradiol probablemente actúa vía estimulación de la secreción de FSH.

6. Métodos • Western blot • Inmunohistoquímica • Análisis morfométricos • Ensayos de hormonas: ELISA, IRMA

7. Modelo: ratón hpg • Gen GnRH truncado  no producen GnRH maduro  no se estimula secreción de gonadotropinas • Desarrollo testicular arrestado  infértiles, testículos vestigiales • Permiten estudio de regulación endócrina de la espermatogénesis.

8. Técnicas • Inmunohistoquímica: procedimiento histopatológico. Se utiliza un anticuerpo específico anti-proteína de interés sobre corte histológico fijado. La detección se puede dar por marcación del Ac 1º (asociado a un fluoróforo) o por incubación con un Ac 2º anti-Ac1º asociado a un sistema de detección (fluorocromo/enzima) Inmunodetección directa Inmunodetección indirecta

9. Técnicas • Radioinmunoensayo (RIA): método radioinmunométrico que se basa en formación específica de complejos Ag-Ac (gran especificidad y sensibilidad) y la competencia entre Ag* (cant conocida) y Ag para formar el complejo: Manteniendo constante la cantidad de Ag* y Ac: > Ag  < Ag* unido a cant fija de Ac (menos radioactividad) De esta forma se puede relacionar la radiactividad con la concentración de Ag, utilizando una recta de calibración • ELISA: mismo fundamento que RIA, pero la medición se realiza por colorimetría

10. 1- Inmunoreactividad de receptores de estrógeno en glándula adenohipofisaria y testículos de ratones wt y hpg Ratones hpg como wt presentan receptores ERα en testículos y glándula adenohipofisaria

11. Localización inmunohistoquímica de ERα en ratones hpg En adenohipófisis: localización nuclear de ERα en ratones hpg y wt. En testículos: inmunoreactividad en núcleos de células de Leydig y células mioides peritubulares.

12. 2- Efectos del estradiol y rhFSH en el peso de órganos reproductivos, y concentración de FSH en suero

13. 2- Efectos del estradiol y rhFSH en el peso de órganos reproductivos, y concentración de FSH en suero Testículos: • rhFSH aumenta peso (> dosis, > aumento) • Estradiol  aumenta peso • Estradiol + rhFSH no aumenta más que los tratamientos individuales Epididimos: • rhFSH solo aumenta significativamente en altas dosis • Estradiol  aumenta peso (solo o con rhFSH) Vesícula Seminal: • Estradiol produce gran aumento (solo o con rhFSH) • rhFSH  no produce efecto en este órgano

14. Los testículos de ratones hpg tratados con colesterol y vehículo (control) están poco desarrollados, con túbulos seminíferos de pequeño diámetro sin lumen. Todos los demás grupos tratados presentan un mayor desarrollo. Histología testicular luego del tratamiento con estradiol y/o rhFSH El tratamiento con la dosis máxima de FSH produjo cambios significativos en el volumen del epitelio seminífero y tubular y la longitud tubular con respecto a los otros tratamientos

15. Células del Leydig en ratones hpg luego del tratamiento con estradiol y/o rhFSH (inmunohistoquímica con 3β-HSD) Las células de Leydig son abundantes en los compartimientos intersticiales de los testículos, pero sólo hay un aumento significativo en el número de células con el tratamiento de 5IU rhFSH.

16. 3- Histología testicular • Sólo estradiol aumenta significativamente nº de cél. de Sertoli (al igual que el tratamiento combinado con rhFSH, y altas dosis de rhFSH) • Sólo 5IU rhFSH aumenta significativamente nº de cél. de Leydig

17. Discusión • Se confirmó la expresión de receptores ERα en testículos y glándula adenohipofisaria de ratones hpg, a niveles comparables con los de ratones wt. • La distribución de ERα en ratones hpg está restringida a cél. de Leydig en el intersticio y cél. mioidesperitubulares. •  estradiol podría potencialmente actuar via ERα en testículos y glánd. adenohipofisaria en ratones hpg.

18. Discusión • El tratamiento combinado con estradiol y rhFSH no produjo una mayor estimulación del epitelio seminífero que el tratamiento con cada hormona por separado: efecto aditivo •  acción del estradiol en ratones hpg es predominantemente indirecta, via estimulación de la secreción de FSH de la glándula adenohipofisaria.