UNIVERSITÀ DEGLI STUDI “ MAGNA GRÆCIA “ DI CATANZARO FACOLTÀ DI FARMACIA Cattedra di Chimica Farmaceutica e Tossicologic

1. UNIVERSITÀ DEGLI STUDI “MAGNA GRÆCIA “DI CATANZAROFACOLTÀ DI FARMACIACattedradiChimica Farmaceutica e Tossicologica I Scuola Specializzazione in Farmacia Ospedaliera Inibitori Selettivi della Tubulina Dott. Christian CeliaProf. Stefano Alcaro

2. Identificazione struttura tubulina • Costituente principale dei microtubuli è un αβeterodimero coinvolto in numerosi processi di regolazione omeostatica delle cellule eucariotiche • Le differenti funzioni svolte li rende il bersaglio selettivo di numerosi composti in grado di modulare il processo di differenziazione cellulare • Utilizzati come modello recettoriale per la progettazione di composti in grado di modulare i processi di polimerizzazione/depolimerizzazione dei microtubuli

3. Modello molecolare • Il modello molecolare utilizzato per descrivere il processo d’interazione lingando recettore è stato il paclitaxel • Il paclitaxel presenta un sito di legame specifico sulla sub-unità β della tubulina • Il sito di legame del paclitaxel è stato identificato attraverso studi di Binding ed Analisi Cristallografica

4. Descrizione del modello cristallografico della tubulina • Dominio N-terminale (colore azzurro): • 6 β-foglietti (S1-S6) • 2 α-eliche (H1-H6) • Sito legame ligando (Loop T1-T6) • Sito di legame costituito da 3 α-eliche (H8-H10) e 3 β-foglietti (S7-S10)

5. Descrizione del modello cristallografico della tubulina • Dominio C-terminale (colore rosso): • 2 α-eliche antiparallele (H11-H12) • Superficie interna formata da serie di loop (H1-S2), (H2-S3) e (S9-S10)

6. Farmaci antimitotici • Composti di origine naturale in grado di inibire il processo di polimerizzazione/depolimerizzazione dei microtubuli • Farmaci antimitotici di maggior interesse terapeutico: Taxani ed Epotiloni

7. Taxani Composti antitumorali di origine naturale ottenuti: • mediante processi di estrazione dalla corteccia di Taxsus Braevifolia (Paclitaxel)e Taxsus Baccata (Docetaxel) • mediante semi-sintesi chimica a partire dalla 10-desacetilbaccatina

8. Formula di struttura generale dei taxani • SAR dei Taxani: • Sostituenti sul C-2; C-6; C-10 e C-12 composti attivi; • Sostituenti C-14 e porzione anello da C-1 a C-5 essenziali per l’attività; • Apertura anello 8 termini riduzione attività antineoplastica; • OH su C-2΄ e benzoile su C-2 essenziali per citotossicità; • Acetato in 4 influenza la conformazione del composto; • OH su C-7 non modifica attività del composto; • OH su C-1 essenziale per attività del composto.

9. Struttura molecola Paclitaxel e Docetaxel

10. Struttura del Paclitaxel Rappresentazione grafica della molecola di Paclitaxel inserita nel sito di legame all’interno della struttura recettoriale nella macromolecola tubulina

11. Interazioni eterodimero αβ-tubulina-taxolo • Sito di legame del taxolo su M-loop (S9-S10) • Contatti laterali con protofilamenti tubulina (α-elica in H6; loop H1-S2; α-elica H3) • segmento terminale complesso recettoriale (loop T7)

12. Analisi stereoscopica del processo d’interazione tra il taxolo e gli aminoacidi del sito di legame • Angolo di rotazione del anello aromatico in catena laterale influenza affinità del composto per il sito recettoriale (modifica M-loop su entrambe le sub-unità di tubulina); • In H1 Val23 superficie idrofobica con fenile sul C-3΄; • Asp26 legame idrogeno con N catena laterale; • Nel loop H6-H7: • Leu217 e Leu219 interazione idrofobica con il fenile su C-2; • Nella struttura ad α-elica: • Ala233 e Ser236 interazione fenile su C-3΄ e interazione di tipo idrofobica si forma tra la molecola di taxolo e Phe272

13. Analisi stereoscopica del processo d’interazione tra il taxolo e gli aminoacidi del sito di legame Il legame dell’anello taxanico alla sub-unità β della tubulina avviene a livello dell’M-loop ed in particolare a livello degli aminoacidi: Pro274; Leu275; Thr276; Ser277; Arg278; e del loop S9-S10 formato dagli aminoacidi Pro360;Arg369; Leu371 che costituiscono il sito di legame

14. Modello conformazionale dell’interazione tra Paclitaxel e sub-unità βI della tubulina • Anello fenilico su C-2 interazione idrofobica con aminoacidi Leu217; His229; Leu230; • Acetato su C-4 legami idrofobici con aminoacidi Phe272; Pro274; Leu371; • 2 legami idrogeno tra O carbonilico dell’anello in C-8 e l’NH dell’aminoacido Gly370; • OH su C-7 forma 2 legami idrogeno con i carbonili degli aminoacidi Ser277 e Gln282; • legami idrogeno tra acetato su C-10 e catena laterale Arg284

15. Modello conformazionale dell’interazione tra Paclitaxel e sub-unità βIII della tubulina • Riduzione interazione recettore con porzione C7-C10 del paclitaxel; • Arg278 forma 2 legami idrogeno con i carbonili su C-9; • Ser277 forma 1 legame idrogeno con carbonile in C-9 e con OH della Ser280; • Glu27 interagisce con Arg320 e forma un legame con Ser241; Isoforma βIII rispetto alla βI presenta la sostituzione dell’aminoacido Ser277 con l’aminoacido Ala277 impedisce la formazione di legame idrogeno tra recettore e carbonile in C-7 del PTX)

16. Analisi CoMSA e CoMFIA Bioattività della molecola può essere determinata sperimentalmente utilizzando due metodiche di analisi: • CoMFA (comparative molecular field analysis) • CoMSIA (comparative molecular similarity index analysis) Entrambe le metodiche forniscono informazioni sulle caratteristiche idrofobiche, steriche ed elettrostatiche del modello ligando-recettore

17. Rappresentazione grafica mediante analisi CoMFA della molecola di Paclitaxel Poliedro verde rappresenta una zona recettoriale in cui il gruppo fenilico del paclitaxel inteagisce con Arg320; Asp26; Ser236. Regione colore grigio la presenza di un fenile su C-10 riduce affinità di legame ed attività antineoplastica La presenza di un fenile su C-3΄ riduce interazione con Arg320; Asp26; Val23; Ser236 Lo stesso effetto in questa regioni può essere ottenuto inserendo un t-butile o un acetato sulC-4 del PTX Poliedro colore giallo rappresenta una regione sfavorita per l’interazione ligando-recettore; caratterizzata da presenza di Val23 ed Ala233

18. Rappresentazione grafica mediante analisi CoMFA della molecola di Paclitaxel Poliedro rosso spazio conformazionale C-1, 10, 14; Colorazione in rosso gruppi donatori di elettroni importanti per attività Sostituzione acetato su C-10 aumento attività composto Sostituenti su C-1 e C-14 interazione con poliedro rosso; Poliedro blu regione spazio conformazionale ricca di gruppi accettori di elettroni

19. Rappresentazione grafica delle interazioni idrofobiche del Paclitaxel mediante analisi CoMSIA Poliedro giallo costituito da residui Pro360 (gruppi alifatici saturi ed insaturi su C-3΄); Arg360; Ser236; Val23; Ala233 (regione idrofobica nel sito targeting) Poliedro colore bianco circonda i sostituenti metilici in catena laterale sull’anello aromatico su C-3΄ Introduzione di sostituenti lipofili aumenta l’attività del composto

20. Rappresentazione grafica dei gruppi accettori di legami idrogeno del Paclitaxel mediante analisi CoMSIA Regione C-1΄ e C-2΄ sugli aminoacidi Arg369; Gly370; Pro360 (aumentano attività molecola) Sostituente metilico su C-17 del gruppo acetato dell’aminoacido Glu281 Regione ricca di gruppi donatori di legami idrogeno Regione con pochi donatori di legami idrogeno caratterizzati da presenza di aminoacidi Asp26; Pro360 (regione favorevole per legame tra ligando e recdettori)

21. Rappresentazione grafica dei gruppi donatori di legami idrogeno del Paclitaxel mediante analisi CoMSIA Poliedro in magenta (maggiore possibilità di formare legami per presenza di gruppi accettori di legami idrogeno) formata da aminoacidi Gly370 e Leu371; Poliedro colorato in rosso (pochi gruppi accettori di legami idrogeno) 20% possibilità formare legami

22. Modello farmacoforico della molecola di taxolo mediante analisi CoMFA e CoMSIA

23. Epotilone • Composto strutturalmente simile al taxolo, identificato da Hofle e dai suoi collaboratori nel 1993 • Prodotto di estrazione da alghe marine, inibisce il processo di depolimerizzazione dei microtubuli stabilizzando il fuso mitotico • Rispetto al taxolo ed ai suoi derivati presenta: maggiore solubilità in acqua; sfugge ai meccanismi di inattivazione mediati dalla Gp-120; possiede azione citotossica selettiva su modelli in vitro di cellule tumorali; induce apoptosi

24. Analisi EC del complesso epotilone A- β-tubulina Carbonili C-1; OH su C-3; carbonile su C-5 ed OH su C-7 interagisce con Thr274; Arg278; Arg282 localizzati su M-loop della tubulina; NH azoto tiolico interagisce con l’His227; interazioni idrofoboche tra C-3 e C-11; 2 gruppi fenilici su C-13 ed OH su C-2΄ non coinvolti in interazioni ligando-recettore; O etereo del taxolo interagisce con Thr274 in M-loop; metile su C-18 forma contatti idrofobici con la macromolecola

25. Analisi delle interazioni elettroniche tra epotilone e macromolecola tubulina Sostituzione metile tiazolico su C-21 formazione derivato attivo; sostituzione gruppo epossidico con aziridina forma composti attivi; analoghi NCOOC6H5 e NCOC6H5 modificano polimerizzazione tubulina

26. Interazione di legame tra epotilone e sub-unità βI della tubulina Conformazione E1: interazione a livello dell’α-elica su H-7; interagisce con struttura recettoriale sia attraverso legame idrogeno tra i gruppi idrossilici su C-3 e C-7 e le catene laterali di Arg278 e Gln282; interazioni π-π tra anello tiazolico ed His229

27. Interazione di legame tra epotilone e sub-unità βIII della tubulina In E3 forma legami idrogeno con Gly370; mantiene inalterate sia le interazioni tipo van der Waals con His229; legame idrogeno tra carbonile su C-5 ed aminoacido Arg278; struttura stabilizzata da legami idrogeno tra residui aminoacidici in posizione 277 e 280

28. Conclusioni • Tubulina presenta una struttura ben definita con siti di legame specifici • Affinità di legame influenzata dalla natura degli aminoacidi della tasca recettoriale e dall’isoforma della tubulina stessa • Paclitaxel ed Epotiloni competono con lo stesso sito di legame sulla macromolecola