12. Ciclo celular y crecimiento de poblaciones microbianas

1. 12. Ciclo celular y crecimiento de poblaciones microbianas Crecimiento a nivel individual. Crecimiento de poblaciones: medida de masa y nº de células. Crecimiento balanceado. Cultivo continuo. Curva de crecimiento en sistema cerrado

2. Introducción al crecimiento microbiano (I) • Crecimiento: incremento ordenado de todos los componentes del sistema biológico  aumento de la masa celular  multiplicación celular • En microorganismos que se dividen por fisión o por gemación  aumento del nº de individuos • En microorganismos cenocíticos  aumento del tamaño de la colonia cenocítica

3. Introducción al crecimiento microbiano (II) • Puntos de vista de estudio: • Individual: ciclo celular • Replicación y segregación de cromosomas • Síntesis de nuevos materiales de las envueltas (ver tema 5) • Coordinación de la replicación y la división celular • Poblacional • Cinética del crecimiento • Factores que afectan al tiempo de generación (g) • Factores ambientales que afectan al crecimiento • Físicos (tema 13) • Químicos (tema 14)

4. Ciclo celular • Secuencia de acontecimientos identificables que ocurren desde que surge una nueva célula hasta que ésta se divide en dos hijas • En el ciclo procariótico existen períodos • C: replicación del ADN cromosómico • D: formación del septo y división celular • Fase innominada, equivalente a la G1 eucariótica • C y D son relativamente constantes  cuando disminuye g lo hace a expensas de G1

5. Ciclo celular en función del tiempo de generación • g>C+D: existe G1 (intervalo antes de la replicación). C y D están perfectamente diferenciados • g=C+D: no existe G1. Cada ronda de replicación empieza al terminar una división celular • g<C+D: rondas de replicación de un ciclo empiezan antes de que haya terminado la división celular del ciclo anterior (C y D parcialmente superpuestas) • g<C: no se detecta fase D. La síntesis de ADN es continua en todo el ciclo. Replicación dicotómica de los cromosomas

7. Control del ciclo celular en Escherichia coli (I) • Dos secuencias paralelas de acontecimientos controlan el ciclo: • Un control es sensible a una masa celular umbral, y está implicado en desencadenar la replicación cromosómica • Otro control es sensible a una longitud celular umbral, y tiene que ver con el reparto de los cromosomas y la formación del tabique

8. Fase C Fase D

9. Control del ciclo celular en Escherichia coli (II) • Inicio de la replicación (sensible a masa umbral): • Unidades de DnaA (+ATP) se unen a oriC. El oriC tras la replicación queda hemimetilado, y queda “secuestrado” en la membrana (para evitar la acción de la metilasa Dam) • Inicio de tabicación (sensible a longitud umbral y a la separación de los cromosomas): • Formación en el centro celular de un círculo de FtsZ, que se va contrayendo • Ensamblaje en ese plano del divisoma, incluyendo la PBP3  síntesis de PG del tabique

11. Medida del crecimiento por masa celular (I) • Métodos directos: • Determinación del peso húmedo • Determinación del peso seco • Determinación del N total • Determinación de algún componente característico: • PG • ADN, ARN • Proteínas • ATP • Clorofilas (en fotosintéticos)

12. Medida del crecimiento por masa celular (II) • Métodos indirectos: • Consumo de nutrientes • QO2 (consumo de oxígeno) • QCO2 (consumo de dióxido de carbono) • Producción de ciertos metabolitos • Producción de ácidos orgánicos • Métodos turbidimétricos (ópticos): • Espectrofotómetro (mide luz transmitida) • Nefelómetro (mide luz dispersada)

13. Espectrofotómetro en medida del crecimiento

14. Medida del número de individuos (I) • Métodos directos: • Cámara de Petroff-Hauser (para bacterias) • Cámara de Thoma (para levaduras y células mayores que las bacterianas) • Contadores electrónicos de partículas (contador Coulter)

15. Cámara de Petroff-Hauser

16. Medida del número de individuos (II) • Métodos indirectos: • Recuento de viables por siembra de muestras de diluciones en placas de Petri • Recuento de viables a partir de grandes volúmenes de suspensiones diluidas: se hacen pasar por filtros de nitrocelulosa o equivalentes (ej.: sistema Millipore®), y se incuban sobre medio sólido

17. Dispersión sobre la superficie de placas Petri Medio en sobrefusión se añade a una muestra

18. Recuento de viables por siembra en placas Petri Alícuotas 0.1 ml 106 10 x

19. Sistema de filtración en membrana de Millipore®

20. Filtración por membrana de Millipore® de una muestra

21. Crecimiento balanceado (=equilibrado) (I) • El incremento por unidad de tiempo constituyentes de la población es un valor constante y similar en cada caso: • velocidad de aumento del componente = K · [cantidad de ese componente] (cinética orden 1) • Es decir: el nº de células, la masa u otros componentes se duplican en un mismo lapso de tiempo  • tiempo de generación (g)

22. Crecimiento balanceado (=equilibrado) (II) • Otra manera: todos los constituyentes aumentan proporcionalmente por un mismo factor en la unidad de tiempo  coeficiente exponencial de crecimiento μ • Se deduce fácilmente la relación entre μ y el tiempo de generación (g): • μ = 0.693/g (en h-1)

25. Cultivo continuo(sistema abierto) • cultivo balanceado mantenido por tiempo indefinido por un sistema abierto de flujo compuesto por: • Una cámara de cultivo de volumen constante • A la que llega un suministro de nutrientes desde una cámara reservorio • Desde la cámara de cultivo se elimina parte del cultivo y de sustancias tóxicas por un dispositivo de rebosadero

26. Medio fresco desde reservorio Válvula para controlar el flujo f (en ml/h) Pérdida neta céls: -dx/dt = x·D Crecimiento bruto: dx/dt = x· μ Crecimiento neto: dx/dt = x· μ - x·D = = x (μ-D) En equilibrio μ = D; luego dx/dt = 0 y x se hace constante D = f/v (en h-1) v x f (en ml/h)

27. Reservorio de medio fresco, con un sustrato limitante (SR) SR Válvula de control del flujo D = f/v Suministro de aire Filtro de aire Cámara de cultivo v Receptor del efluente rebosado

28. x g DM DC

30. Crecimiento en sistemas cerrados líquidos • El más habitual en laboratorio • Cultivo en frascos, tubos, etc. • No hay aporte nuevo de nutrientes ni es posible eliminar los productos de desecho del cultivo • Se desarrolla a través de una curva característica de crecimiento7

31. 4 6 7 5 3 2 1