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養殖成年母烏魚之奴卡氏菌 ( Nocardia seriokae ) 的分離及其特性研究

養殖成年母烏魚之奴卡氏菌 ( Nocardia seriokae ) 的分離及其特性研究. 黃世鈴 1* 黎錦超 2 蘇淑貞 2 施美娟 1 陳秀男 2 1 行政院農委會水產試驗所 淡水繁養殖研究中心 2 國立台灣大學漁業推廣委員會. 指導老師：古鎮鈞 姓名：郭珍妤 學號： 1092407053. 前言.

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養殖成年母烏魚之奴卡氏菌 ( Nocardia seriokae ) 的分離及其特性研究

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Presentation Transcript

  1. 養殖成年母烏魚之奴卡氏菌(Nocardia seriokae)的分離及其特性研究 黃世鈴1*黎錦超2蘇淑貞2施美娟1陳秀男2 1行政院農委會水產試驗所 淡水繁養殖研究中心 2國立台灣大學漁業推廣委員會 指導老師：古鎮鈞 姓名：郭珍妤 學號：1092407053

  2. 前言 • 革蘭氏陽性菌感染症，曾經造成台灣水產生物重大病害，主要的病原菌包括奴卡氏菌(Lai et al., 1991)、鏈球菌(董等, 1985)及表皮葡萄球菌(Huang et al., 1999, 2000)等。其所引起的疾病，大都屬於亞急性或慢性病害，容易形成肉芽腫病變。 • 在1998年12月，彰化縣鹿港地區半淡鹹水養殖之2~3年生烏魚，發生嚴重病害病出現連續性大量死亡，解剖後發現其各內臟器官出現無數的白結節等。

  3. 也有養殖的大嘴鱸魚、七星鱸魚、吳郭魚等魚種都有罹患Nocardia sp.感染症狀，體內器官都有出現肉芽腫病變及結節。

  4. 台灣魚類資料庫 • 脊椎動物亞門 Subphylum Vertebrata • 條鰭魚綱ClassActinopterygii • 新鰭亞綱Subclass Neopterygii • 鯔形目OrderMugiliformes • 鯔科FamilyMugilidae • 鯔屬GenusMugil • 鯔Mugil cephalus • 俗名 信魚、正烏 、烏魚

  5. 材料與方法 • 罹病魚採樣 • 解剖檢查 • 組織病理學研究 • 細菌之分離及鑑定 • 掃描式電子顯微鏡觀察 • 攻擊試驗

  6. 罹病魚採樣 • 罹病魚於1998年12月採自彰化縣爆發嚴重病害之養殖池，為2~3年生供作剖取烏魚子用之養殖池之成年母烏魚。

  7. 解剖檢查 • 解剖病魚後，直接用肉眼觀察各組織器官是否變紅、腫脹或潰爛，並詳細檢查脾、腎、肝、生殖腺、腸繫膜、消化道、心臟、鰾、及肌肉等出現白色結節的情形。

  8. 組織病理學研究 將採自上述病魚之鰓絲、脾臟、頭腎、幹腎、肝臟、肌肉、心臟、腦、消化道、 及鰾等組織，以10％中性福馬林溶液固定，經脫水包埋 利用旋轉式切片機(Yamato)切成4~6μm 厚度之切片，並以H＆E染色 (H＆E stain)、 齊耳-倪耳生二氏染色(Ziehl-Neelsenacid-fast stain)及吉氏染色(Giemsa stain)等 染色完成後，用封片膠 (Mearck)封蓋，置於光學顯微鏡(Nikon, UFX-ⅡA)下觀察組織 病理變化

  9. 細菌之分離及鑑定 • 使用接種環從罹病魚之脾臟及腎臟結節區分離、純化出十珠細菌，以腦心浸出培養液培養基(BHIA)，在30℃下連續培養7天後，進行生化特性試驗。 • 將其中的A212及B222菌株，進一步以質譜儀(mass spectrometry)、薄層色譜法 (thin-layer chromatography；簡稱TLC)、高效能液相層析儀(high performance liquid chromatography)及 甘醇酸酯測試(glycolate test)等分析細菌細胞壁的成分及細胞組成。

  10. 掃描式電子顯微鏡觀察 在腦心浸出培養液培養基中，以30℃培養五天後，細菌懸浮在腦心浸出培養液，調整 細菌濃度為1.6×107cfu/ml(每毫升落菌數) 將菌液植入24well培養皿，在培養箱以30℃培養24小時後，於4℃下，用2.5％戊二 醛固定2小時，再用1％鋨四氧化物固定1小時 固定完後，細胞暫存於100％丙銅中，送至電顯示作臨界點絕對乾燥及鍍碳後， 用掃描式顯微鏡觀察

  11. 攻擊試驗 菌株A212培養在腦心浸出培養液培養基中，在30℃下連續培養7天， 用0.85％的 NaCl將細菌洗下，離心後在洗滌3次，離心條件為5,000g，4℃，10分鐘 再將細菌懸浮在0.85％NaCl，調整濃度為2.6×105cfu/ml (每毫升落菌數) 、 2.6×106cfu/ml (每毫升落菌數)及2.6×107cfu/ml (每毫升落菌數) 試驗分4組進行，每組10尾試驗魚(烏魚)，每尾注射0.5ml細 菌懸浮物(腹腔注射)，對照組注射0.5ml之0.5％ NaCl，試驗期間為60天

  12. 結果 • 現場調查 • 外觀症狀 • 解剖檢查 • 細菌分離及檢查 • 組織病理變化 • 細菌攻擊試驗

  13. 現場調查 • 病害發生於1998年12月，罹病魚池位於彰化縣鹿港正沿海地區。 • 發病後，每天都有烏魚死亡，累計死亡率超過20％，而且會迅速出現大量死亡現象，但偶有少數病魚會在池底或水表面打轉。

  14. 外觀症狀 • 病魚體側及腹面出現局部出血及潰瘍區，潰瘍區鱗片容易脫落。潰瘍區會併發黃白色的粘液細菌或水黴菌感染，少數病魚會出現眼球突出、眼球白濁及腹水等症狀。 即將死亡的魚體皮膚上有潰瘍和充血， 很多分泌的黏液和眼球突出。

  15. 解剖檢查 • 罹病魚解剖後，可發現腮、消化道、膽囊(1C)、肝臟、脾臟、腸繫膜、生殖腺、及鰾壁(1D)等均出現結節的症狀，但以脾臟及腎臟最為嚴重。 膽囊包含了許多小結節。膽囊(Gb)、肝臟 (L)、腸(In)；箭頭箭頭指出為小結節。 氣體膀胱包含了許多小結節。 氣體膀胱(Gs)；箭頭箭頭指出為小結節。

  16. 病情劇烈者，脾臟的皮質及髓質部分會均勻散佈大小不一的結節。病情劇烈者，脾臟的皮質及髓質部分會均勻散佈大小不一的結節。 • 心臟及肌肉組織則未發現結節，腸管出現呈現泛紅或變白等症狀，腸腔內無食物堆積，但蓄積氣泡及不正常液體。 脾臟包含了許多小結節。卵巢(Ov)、 腸(In)、脾臟(Sp)、膽囊(Gb)、肝臟(L) ；箭頭箭頭指出為小結節。

  17. 細菌分離及檢查 從罹病魚之脾臟分離純化之10株(A212、A212-2、A212-3、A213、B214、B215、B216-1、B216-2、B220、B222)，經鑑定後，均屬於革蘭氏陽性菌，以齊耳-倪耳生二氏染色劑(Ziehl-Neelsen acid-fast) 染色呈弱陽性反應。

  18. 各菌株之生化特性試驗結果 溶菌酵素抵抗力(Lysozyme resistance)為〝+〞反應

  19. 〝+〞：正反應 〝-〞：負反應 〝+w〞：微弱正反應

  20. 菌株A212(A)及B222(B)在掃描電子顯微鏡觀察下，細菌得營養菌絲會行成分枝，分裂為英文字母Z型或桿狀，形狀明顯且特殊，可做為分類上判斷的佐證。菌株A212(A)及B222(B)在掃描電子顯微鏡觀察下，細菌得營養菌絲會行成分枝，分裂為英文字母Z型或桿狀，形狀明顯且特殊，可做為分類上判斷的佐證。

  21. 菌株A212及B222之細胞壁胺基酸為meso-DAP，全細胞醣類成份分別為galactose及arabinose，係屬於chemotyopwe IV A型，主要的脂肪酸成份為直鏈狀。

  22. A212及B222的特徵

  23. 組織病理變化 • 除了腦、心臟及肌肉外，罹病魚在腮、消化道、肝臟、脾臟、腎臟、腸繫膜、生殖腺等器官均出現大小不一的肉芽腫組織，其中以脾臟(A)及腎臟最為嚴重。 • 肉芽腫組織由類上皮細胞或纖維組織包為成同心圓區域，中央壞死區可發現大量的分枝桿菌叢(B)。

  24. 細菌攻擊試驗 • 以A212菌株進行細菌攻擊試驗，結果顯示，無論以2.6×105cfu/ml (每毫升落菌數) 、2.6×106cfu/ml (每毫升落菌數)或2.6×107cfu/ml (每毫升落菌數)細菌攻擊試驗組及對照組，所有試驗於外觀與行為均正常。 • 試驗結束解剖試驗魚，分別以肉眼即由組織切片觀察，結果顯示各組試驗魚之組織器官均正常，未發現結節。

  25. 討論 • Nocardia sp. 係廣泛存在於土壤中的細菌，為陸地上動物、水生動物及人類等的病原菌之一，被侵犯的動物包括牛、羊、狗、馬、猴、天竺鼠、家禽及魚類等。 • 1962~1963年間首度發現鱒魚苗被 Nocardia屬細菌感染，屬於慢性病(Snieszko et al., 1964)。

  26. 在日本，集約式養殖之魚類常受到格蘭氏陽性菌Enterococcus serilicda及 N. kampachi等之嚴重感染，而引發大量死亡(Kusuda and Salati, 1993)。 • 台灣的養殖魚類中，鱧魚(蕭與陳,1977；徐等,1987)、大嘴鱸魚(Lai et al.,1991)、七星鱸(李等,1999)等均曾遭受Nocardia sp.侵襲，病魚體內各組織器官會出現結節症狀，細菌型態為分枝狀長桿菌。

  27. 本研究之案例發生於1998年開始，自發病後，魚池累計死亡率超過20％。本研究之案例發生於1998年開始，自發病後，魚池累計死亡率超過20％。 • 從1998年，每年均陸續發現相同病例，平均死亡率在5~20％之間。

  28. 台灣在1992~1996之間，各地區養殖之吳郭魚發生S. epidermidis感染症，典型的臨床症狀，係在各內臟器官出現大量大小不一的白色結節，結節組織學上呈肉芽腫病變。 • 其症狀與本研究之N. seriolae感染症類似，是否該兩種細菌具有攻擊對象種別，或兩種魚類對於致病微生物有其特異性，還需進一步求證。

  29. 何謂肉芽腫 • 肉芽腫組織係由多層類上皮組細胞包被，或纖維組織包為形成的同心圓，而中央為壞死區。

  30. 罹病魚在感染初期無症狀反應或僅出現輕微症狀，所以容易乎略而失去最佳的治療時期。罹病魚在感染初期無症狀反應或僅出現輕微症狀，所以容易乎略而失去最佳的治療時期。 • 當各器官出現無數大小不一的結節時，病況通常已進入中期或末期，組織器官會因此失去大部分的功能，導致罹病魚容易再遭受其他病害的二次感染，也對環境巨大變動之抵抗力減弱，因此容易發生大量死亡。

  31. ~報告結束~

  32. 質譜儀(mass spectrometry, MS)是以熱電子撞擊氣體分子，使產生碎片及離子，再經磁場分離，依據質荷比之測量，來決定分子質量的技術。而質量是分子的一種特質，因此可以用於分子的鑑定或確認。

  33. 樣本處理方式 • 質譜儀分析時，樣品必須先進行離子化，因樣品其物理、化學性質不同，而有各種不同離子化方式，一般易揮發性樣品則用電子撞擊游離法(electron impact ionization, EI)，或化學游離法(chemical ionization, CI)。 • 非揮發性樣品，則用快速原子撞擊(Fast atom bombardment, FAB)，或電灑法(electron spray ionization, ESI)等。 • 因此各種樣品選擇適當的離子化法，再經質譜分析，即可進行樣品之結構性分析級定量分析測定。

  34. 薄層色譜法(ThinLayerChromatography，簡稱TLC)，又稱薄層層析，屬於固－液吸附色譜。是色譜法中的一種，是快速分離和定性分析少量物質的一種很重要的實驗技術，它兼備了柱色譜和紙色譜的優點，可適用於少量樣品（幾到幾微克，甚至0.01微克）的分離；也可適用在製作薄層板時，把吸附層加厚加大，因此，又可用來精製樣品 。

  35. 高效能液相層析儀(HPLC)分類 • “正相”( normal phase )：高效能液相層析儀系統中，移動相的極性較低，固定相的極性較高。 • “逆相”( reverse phase )：高效能液相層析儀系統中，移動相的極性較高，靜相的極性較低。

  36. 原理 • 高效能液相層析儀的原理係藉移動相通過靜相達到分離的效果；混合物中的各成份在靜相和移動相之間的分配係數不相同（即親和力不同），使其在管柱中的滯留時間不相同而得以分離出來。

  37. 化合物與靜相親和力較強，則沖提較慢（即滯留時間長），而化合物與移動相的親和力較強，則沖提較快（即滯留時間短），依此原理將樣品中的標的待測物與共萃取出來的干擾物分離的方法。化合物與靜相親和力較強，則沖提較慢（即滯留時間長），而化合物與移動相的親和力較強，則沖提較快（即滯留時間短），依此原理將樣品中的標的待測物與共萃取出來的干擾物分離的方法。

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