Identificazione mediante analisi dei lipidi della parete

1. Identificazione mediante analisi dei lipidi della parete

2. gli acidi micolici • acidi grassi, ramificati in posizione β • presenti nella parete batterica dei generi: • Corynebacterium: 22-38 atomi di C • Rhodococcus: 34-52 atomi di C • Nocardia: 44-60 atomi di C • Gordonia: 48-66 atomi di C • Tsukamurella: 64-78 atomi di C • Mycobacterium: 60-90 atomi di C • presenza di numerosi gruppi funzionali che differenziano 7 tipi di acidi micolici micobatterici • alfa-, alfa'-, metoxi-, keto-, epoxi-, waxester-, omega'metoxi-mycolati

3. altri lipidi complessi acidi micolici arabino-galattano peptidoglicano • membrana cellulare la parete dei micobatteri

4. Catena alchilica principale (38-58C) CHOH CH-COOH Ramificazione alchilica (21-23C) CH2 struttura degli acidi micolici

5. cromatografia su strato sottile • separazione dei vari ac. micolici su piastre di gel di silice e successivo evidenziamento mediante opportune colorazioni • identificazione delle “macchie” in base alla loro posizione rispetto al fronte di avanzamento della fase mobile • identificazione del microorganismo in base al pattern di acidi micolici

6. cromatografia su strato sottile

7. gas-cromatografia • pirolisi degli acidi micolici in esteri metilici saturi di 22, 24 e 26 atomi di C • separazione dei prodotti di clivaggio nonché degli acidi grassi saturi ed insaturi (fra i quali l’acido tubercolostearico) e degli alcol • identificazione delle catene di C preferibilmente usando la spettrometria di massa • identificazione del microorganismo in base al pattern di acidi grassi

8. gas-cromatografia

9. il principio della HPLC • la fase mobile è spinta ad elevata pressione attraverso la fase stazionaria (particelle paccate) contenuta nella colonna • il campione viene iniettato direttamente all'interno del flusso della fase mobile • la separazione delle varie frazioni del campione è determinata dalla diversa polarità delle due fasi • le frazioni eluite vengono quantizzate in base alla loro assorbanza

10. colonna iniettore pompe detector solventi cromatogramma recorder le componenti del sistema

11. preparazione del campione • saponificazione • una ansata di colonie in potassa alcolica per 1h a 121°C • estrazione • aggiunta di cloroformio dopo acidificazione • evaporazione dello strato non acquoso • aggiunta di bicarbonato e ulteriore evaporazione • solubilizzazione del residuo secco in cloroformio • derivatizzazione • esterificazione con bromofenacil bromuro, in presenza di catalizzatore, per 40 min a 80°C • evaporazione e aggiunta al residuo secco di cloroformio, ac.cloridrico e metanolo • recupero ed evaporazione dello strato di cloroformio

12. identificazione dei picchi 1 TRR=5,3/9,6 SI 5,3 9,6

13. identificazione dei picchi 2 SI1 SI2

14. esempi di profili HPLC M. tuberculosis M. simiae

15. le fasi del processo di identificazione mediante HPLC • confronto visivo del profilo comatografico in esame con quelli di specie note identificando, quando necessario, i picchi in base ai tempi di ritenzione relativi • il riconoscimento, per confronto con i tracciati cromatografici presenti in memoria, è operato da un apposito software

16. i vantaggi dell'impiego della HPLC • rapido (poche ore) • single-step • specie-specifico • economico • utilizzabile per: • diagnostica clinica (identificazione isolati) • ricerca (riconoscimento di nuove specie)

17. i limiti della HPLC • specie con profili simili (MAC e M.scrofulaceum, nuovi micobatteri a crescita rapida) • apparecchiatura costosa • non utilizzabile direttamente sui materiali clinici