Fisiologia microbiana: nutrição e crescimento

1. Fisiologia microbiana:nutrição e crescimento • Nutrição microbiana • Componentes necessários às células • Meios de cultura • Condições ambientais • Crescimento populacional • Velocidade de crescimento • Tempo de geração • Medidas do crescimento

2. Introdução NUTRIÇÃOMICROBIANA • De todos os organismos vivos, os microrganismos são os mais versáteis e diversificados em suas exigências nutricionais. • Alguns são tão exigentes quanto o homem e outros animais. • Todos os organismos vivos compartilham algumas necessidades nutricionais em comum: - carbono - nitrogênio - água

3. NUTRIÇÃO MICROBIANA • Em algumas situações os microrganismos são estudados em seu hábitat natural. Ex.:Fendas termais, sistemas de tratamento de resíduos, solo • Para caracterizar suas propriedades (morfológicas, fisiológicas e bioquímicas) é necessário o cultivo em laboratório. Cultivo in vitro: quando se conhece as exigências nutricionais Cultivo in vivo: quando exigências nutricionais específicas são desconhecidas.

4. NUTRIÇÃO MICROBIANA • Para o cultivo in vitro são utilizados meios de cultura que simulam e até melhoram as condições naturais. • Os elementos químicos principais para o crescimento das células incluem C, N, H, O, S e P e são denominados de macronutrientes. • O carbono é um dos elementos mais importantes para o crescimento microbiano – todos requerem carbono • Os compostos orgânicos são os que contém carbono • Exceção para o dióxido de carbono que é considerado como inorgânico.

5. NUTRIÇÃO MICROBIANA MACROnutrientes: necessários em grande quantidade. Tem papel importante na estrutura e metabolismo. MICROnutrientes: quantidades mínimas. Funções enzimáticas e estruturais das biomoléculas Uma célula típica

6. Componentes necessários às células • Fonte de Carbono • Compostos orgânicos (microrganismos heterotróficos): • - Carboidratos • - Lipídeos • - Proteínas • Deles se obtém energia e unidades básicas para o crescimento celular. • Utilização de CO2 (microrganismos autotróficos) • É a forma mais oxidada do carbono, assim a fonte de energia provém da luz.

7. Componentes necessários às células • Fonte de Nitrogênio - É elemento mais abundante depois do C, cerca de 12% (constituinte das proteínas, ácidos nucléicos, etc.) ► Moléculas orgânicas (aminoácidos, proteínas, etc.) ► Moléculas inorgânicas (NH3, NO3-, N2)

8. Componentes necessários às células • Hidrogênio • Principal elemento dos compostos orgânicos e de diversos inorgânicos (água, sais e gases) • Função do H: • Manutenção do pH • Formação de ligações de H entre moléculas • Serve como uma fonte de energia nas reações de oxi-redução da respiração • Oxigênio • - Elemento comum encontrado nas moléculas biológicas (aminoácidos, nucleotídeos, glicerídeos ...) • - É obtido a partir das proteínas e gorduras. • ► Na forma de oxigênio molecular (O2), é requerido por muitos para os processos de geração de energia.

9. Componentes necessários às células Outros macronutrientes: • P – Sínese de ácidos nucléicos, ATP; • S – Estabilidade de aminoácidos, componente de vitaminas; • K – Atividade de enzimas; • Mg – Estabilidade dos ribossomos; • Ca – Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de endósporos; • Na – Requerido por microrganismos marinhos; • Fe – Papel-chave na respiração, componente dos citocromos e das proteínas envolvidas no transporte de elétrons.

10. Requisitos nutricionais -Micronutrientes • Traços dos seguintes METAIS são necessários na composição de um meio de cultura: Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B ► Exercem função estrutural em várias enzimas - Nem sempre sua adição é necessária - Meios sintéticos com compostos de alto grau de pureza e água ultra pura podem apresentar deficiências desses elementos.

11. Água e outros aditivos • Água • Componente absolutamente indispensável (com exceção dos protozoários que englobam partículas sólidas) ► Laboratório: destilada, filtrada, deionizada • Outros aditivos Funções: aumentar a conversão, evitar precipitação de íons, controlar a espuma, provocar inibição, estabilizar o pH. ►Quelantes: na autoclavagem ocorre a precipitação dos fosfatos metálicos Ex.: EDTA, ácido cítrico, polifosfatos

12. Outros aditivos ►Tampões - Carbonato de cálcio - Fosfatos - Proteínas (peptona) ►Inibidores Ex: produção de ácido cítrico por Aspergillus niger Utiliza-se Fosfato e pH < 2 para reprimir o ácido oxálico

13. Outros aditivos ►Indutores - A maioria das enzimas de interesse comercial precisa de indutores. Ex: celulose induz a celulase pectina induz a pectinase amido induz a amilase ►Antiespumantes - Cultivos com aeração ocorre a produção de espuma • Remoção de células, perda do produto, contaminação; • Redução do volume do meio • Um antiespumante reduz a tensão superficial das bolhas (álcoois, ácidos graxos, silicones, poliglicóis, ... )

14. MEIOS DE CULTURA Soluções nutrientes para promover o crescimento de microrganismos. Classes Quimicamente definidos (sais, compostos orgânicos purificados, água) Complexos (utilizam hidrolisados – caseína, carne, soja, levedura) Não existe um meio de cultura universal, mas Existem vários tipos meios para diversas finalidades Para obter sucesso no cultivo de microrganismos é necessário o conhecimento de suas exigências nutricionais, para que os nutrientes sejam fornecidos de forma e proporção adequada.

15. MEIOS DE CULTURA

16. MEIOS DE CULTURA MEIOS DE CULTURA Passo 1: utilizar dados da composição elementar Ex: Para produzir 10 g de células bacterianas são necessários de 1,3 g (13%) de N, ou 7,2 g de (NH4)2SO4(18% de N) Obs.: Sais com dois componentes [(NH4)2SO4] podem introduzir o excesso de um deles. Com relação ao carbono considerar também fração para energia e manutenção (heterotróficos) Fração para biomassa: 1,3 x 4 = 5,2 g de C ou 13 g de glicose (40% de C) Fração para energia e manutenção (45%): YX/S = 55% 13/0,45 = 28,9 g de glicose Relação C:N = 28,9/7,2 = 4:1 .... E assim por diante. Passo 2: otimização • Como determinar uma composição inicial para um meio de cultivo: Composição elementar média (% do peso seco)

17. Condições ambientais • Temperatura • oxigênio • pH • Radiação eletromagnética • Pressão atmosférica, hidrostática e osmótica

18. Efeito da temperatura no crescimento microbiano

19. Efeito do oxigênio no crescimento microbiano Meio gelatinoso com indicador redox: Rosa quando oxidado Incolor quando reduzido Durante as reações de redução do O2 são formados vários intermediários tóxicos. Ex: H2O2, OH°, O2- Os microrganismos aeróbios e facultativos utilizam enzimas como a catalase para destruir as formas tóxicas Aeróbio Anaeróbio Facultativo Microaerófilo Anaeróbio aerotolerante

20. Sistema para cultivo de anaeróbios Sistema para cultivo de aeróbios

21. CRESCIMENTO MICROBIANO • Em microbiologia crescimento geralmente é o aumento do número de células • Na maioria dos procariotos ocorre a fissão binária: crescimento e divisão • Varia de minutos até dias • Depende muito das condições ambientais • Escherichia Coli - 20 minutos • Pisolithus microcarpus – 2,5 dias

22. O padrão de crescimento é o exponencial

23. Tratando-se bactérias, algas unicelulares e leveduras que se multiplicam por divisão binária, temos: 21 > 22 > 23> 24Onde N = n° microrganismos ao fim de n divisõesN0 é o número inicialO número de gerações será:A velocidade exponencial de crescimento (R) é expressa pelo número de divisões no tempo:A recíproca de R é o tempo de geração:Essas equações não se aplicam a microrganismos filamentosos.Assim, é mais conveniente aplicar-se uma equação mais geral, onde se considera a variação da massa (X), em função do tempo como sendo proporcional a concentração de biomassa presente:

24. Velocidade específica de crescimento: Num cultivo batelada ocorre o aumento da concentração da biomassa Assim, é necessário definir uma velocidade de crescimento que considere a quantidade de biomassa presente. A integração dessa equação diferencial fornece a equação algébrica do crescimento exponencial da biomassa: Ou escrita de outra forma: • Tempo de duplicação: considerando que X = 2.X0i, resulta:

25. O estudo cinético de um cultivo microbiano consiste da análise da evolução dos valores de concentração de um ou mais componentes do sistema, em função do tempo de cultivo.► microrganismo, nutrientes, metabólitos

26. O ciclo de crescimento • A fase exponencial reflete apenas uma parte do ciclo de crescimento de uma população microbiana • O crescimento de microrganismos em um recipiente fechado (batelada) apresenta um ciclo típico com todas as fases de crescimento.

27. Fase Lag Período de adaptação da cultura • Mudança de meio, preparação do complexo enzimático • Reparação das células com danos. 2)Fase exponencial Fase mais saudável das células onde todas estão se dividindo. • A maioria dos microrganismos unicelulares apresentam essa fase, mas as velocidades de crescimento são bastante variáveis: - Procarióticos – crescem mais rapidamente que os eucarióticos - Eucarióticos menores crescem mais rapidamente que os maiores

28. 3)Fase estacionária: Num sistema fechado (tubo, frasco ou biorreator) o crescimento exponencial não pode ocorrer indefinidamente. • Ocorre a limitação por depleção de nutrientes e acúmulo de metabólitos. Divisão = morte → crescimento líquido nulo • Ainda pode ocorrer: metabolismo energético e produção de metabólitos secundários 4)Fase de morte (declínio): • A manutenção de uma cultura no estado estacionário por longo tempo conduz as células ao processo de morte. - A morte celular é acompanhada da lise celular

29. MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO • Podem ser realizadas pelos seguintes métodos: 1) Peso seco total das próprias células – filtração, secagem e pesagem 2) Peso de algum componente celular – extração, secagem e pesagem 3) Variação no número de células a) contagem de células totais b) contagem de células viáveis a) Contagem de células totais (contagem microscópica direta) Utilizam-se câmaras especiais de contagem (lâmina com grade quadriculada) Ex.: Câmara de Neubauer

30. MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO – contagem direta • Vantagens: método rápido e fácil • Desvantagens Não distingue as células vivas das mortas Pode-se omitir células pequenas Células móveis precisam ser imobilizadas Entre outras.

31. MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO – contagem indireta b) Contagem de células viáveis: Contagem das colônias formadas em meio de cultura em placas.

32. Diluição das suspensões celulares Amostras concentradas precisam ser diluídas Razões: Erros devido à junção de células na colônia Restrições podem fazer células viáveis não originar colônias São empregadas várias diluições decimais porque é difícil prever o número de viáveis. É contada a placa com 30 a 300 colônias

33. MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO Outros métodos: Turbidimetria As células dispersam a luz e quanto mais células mais turvo é o meio Pode ser medida com um espectrofotômetro • O uso da turbidimetria exige a construção de uma curva padrão • Turbidez X quantidade de células

34. Contagem eletrônica