Gabriela Czechura III rok, OAM

1. Przydatność diagnostyczna oznaczania niebiałkowych związków azotowych (mocznik, kreatynina, kwas moczowy, amoniak) Gabriela Czechura III rok, OAM

2. Mocznik • głównym azotowy produkt katabolizmu białek w ludzkim organizmie, • powstaje w przebiegu cyklu mocznikowego zachodzącego w hepatocytach, • wydalany głównie przez nerki (90%). Reszta (10%) usuwana przez skórę (z potem) lub degradowana w przewodzie pokarmowym przez bakterie jelitowe. Wartości prawidłowe: 2,9- 6,4 mmol/l (niższe stężenie u dzieci)

3. Cykl mocznikowy

4. Wątroba Nerki Mocz  • wydalanie mocznika z moczem jest wprost proporcjonalne do wielkości przesączania kłębuszkowego (GFR), • to proces ciągły i dlatego we krwi znajduje się zazwyczaj niewielka, stała ilość azotu mocznikowego (BUN), • większość chorób nerek lub wątroby może mieć wpływ na stężenie mocznika we krwi. Jeżeli w wyniku znacznego uszkodzenia wątroby zaburzeniu ulegają procesy syntezy mocznika, wówczas stężenie BUN może się obniżyć.

5. BUN • Tzw. bloodureanitrogen (BUN)- określa ilość azotu zawartą w moczniku krwi. Wartości są używane zamiennie i można je prosto przeliczać: • mg azotu mocznika x 2,146= mg mocznika (60/28= 2, 146)mg azotu mocznika x 0,0357= mmol mocznika

6. Stężenie mocznika w surowicy jest zależne od: • perfuzji nerek i wielkości diurezy, • wielkości GFR, • szybkości syntezy mocznika związanej bezpośrednio z dzienną podażą białka w diecie i katabolizmem białkowym. ! Stężenie mocznika w surowicy nie może być bezkrytycznie używane do oceny przesączania kłębuszkowego (-funkcji nerek). Wskazania do oznaczania stężenie mocznika w surowicy: • ·  różnicowanie przednerkowej i pozanerkowejazotemii (za pomocą współczynnika mocznik/kreatynina), • ·  ocena nasilenia toksemii mocznicowej u chorych z terminalną niewydolnością nerek, • ·  u chorych dializowanych do oceny stanu metabolicznego chorego i nasilenia katabolizmu białkowego.

7. Zmiany stężenia mocznika w surowicy Azotemia • a) Przednerkowa: • upośledzenie perfuzji nerkowej hipoproteinemie, utrata ECF, zawał serca) • łagodne odwodnienie, • wzmożony katabolizm białkowy (zabieg operacyjny, ekstremalne głodzenie), • dieta wysokobiałkowa, • terapia kortyzolem • b) Nerkowa: • Ostra, przewlekła niewydolność nerek, gdy spada filtracja kłębkowa • c) Ponerkowa: • Dowolna przyczyna obstrukcji przepływu moczu (np. obecność kamieni, przerost prostaty, zwężenia nowotworowe).

8. Zmiany stężenia mocznika w surowicy Niskie stężenie mocznika: • Obniżona synteza np. za mało aa do deaminacjii (głodzenie, złe wchłanianie), • Choroby wątroby (uszkodzona synteza), • Zatrzymanie wody, • Rozcieńczenie surowicy wlewami dożylnymi.

9. Współczynnik mocznik/kreatynina W diagnostyce chorób nerek znalazł zastosowanie współczynnikbędący stosunkiem stężenia mocznika do stężenia kreatyniny w surowicy, za pomocą którego można różnicować przyczyny azotemii. Prawidłowa wartość tego współczynnika: ·  dla stężeń mocznika i kreatyniny wyrażonych w mmol/l wynosi około 35 ·  dla wartości wyrażonych w mg/dl wynosi około 25 ·  dla zależności BUN/kreatynina w mg/dl około 12

11. Metody oznaczania mocznika • Ureaza- dehydrogenaza glutaminowa (GLDH)spektrofotometryczna analiza mocznika: ureaza mocznik (NH4)2CO3 GLDH NH4+ + α- ketoglutaran + NADH NAD+ + glutaminian • Używana najczęściej, • Bardzo swoista, • Szybka.

12. Kreatynina • Jest cyklicznym bezwodnikiem kreatyny, • produkowana i wydzielana w stałej ilości, synteza zachodzi w nerkach, wątrobie i w trzustce, w 2 reakcjach enzymatycznych • transportowana jest do różnych tkanek (np. do mięśni i mózgu) gdzie ulega fosforylacji do fosfokreatyny, • stężenie kreatyniny w surowicy zależy od: -całkowitej masy mięśniowej- płci (u mężczyzn jest wyższe niż u kobiet)- od rodzaju diety (dieta bogatomięsna może podwyższyć stężenie kreatyniny w surowicy nawet o 30%- w 1kg mięsa znajduje się 2-5g kreatyny). Mimo tych zależności poziom kreatyniny w surowicy zdrowego człowieka jest wartością stosunkowo niezmienną (wahania dobowe nie przekraczają 15% wartości).

13. Wartości prawidłowe dla kreatyniny są zależne od zastosowanej metody. Typowy zakres: 80- 115 µmol/l (mężczyźni) 53- 97 µmol/l (kobiety) ! Stężenie we krwi jest odwrotnie proporcjonalne do klirensu nerkowego (GFR)

14. Kreatynina jest wydalana z organizmu tylko przez nerki. Do znamiennego podwyższenia stężenia kreatyniny w osoczu dochodzi dopiero wtedy, gdy znaczna część nefronów ulegnie uszkodzeniu i GFR obniży się do około połowy wartości prawidłowej. Zastosowanie kreatyniny w diagnostyce laboratoryjnej chorób nerek

15. Kreatynina a GFR

16. Oznaczanie kreatyniny 1. Metoda enzymatyczna oznaczania kreatyniny przy pomocy kreatyninazy i kreatynazy: kreatyninaza Kreatynina Kreatyna H2O kreatynaza HCOOH + NADH + H+ Kreatyna sarkozyna + mocznik H2O → H2O2 +NAD+ + H2O DF Oksydaza sarkozyny Sarkozyna + O2 formaldehyd + glicyna peroksydaza H2O2 + pochodna fenolu + 4-aminofenazon barwny związek Kreatyninaza- amidohydrolaza kreatyniny Kreatynaza- amidinohydrolaza kreatyny DF- dehydrogenaza formaldehydu

17. kreatyninaza Kreatynina kreatyna H2O Kinaza kreatyny fosforan kreatyny + ADP Kreatyna + ATP H2O Kinaza pirogronianiowa ADP + fosfoenolopirogronian Pirogronian + ATP H2O → H2O2 LDH Pirogronian + NADH+ + H+ mleczan + NAD+

18. 2. Sucha chemia. Metody oznaczania kreatyniny: • Enzymatyczna z deminazą kreatyniny → amoniak + błękit bromofenolowy (pomiar- 600nm) • Enzymatyczna z kreatyninazą i kreatynazą • Reakcja z kwasem 3,5- dinitrobenzoesowym

19. Wskaźniki do oznaczania stężenia kreatyniny w surowicy: – ostre i przewlekłe choroby nerek – zaburzenia przemiany materii, choroby układowe: cukrzyca, hiperurykemia, choroby tkanki łącznej – nadciśnienie tętnicze – niewydolność krążenia, stan wstrząsu, ostra utrata krwi lub płynów ustrojowych – terapia lekami nefrotoksycznymi lub wydalanymi głównie przez nerki – uszkodzenie nerek wywołane zatruciem egzogennym, hemolizą, miolizą

20. Ograniczenia interpretacji wyników: • kreatynina ↑ w okresie dojrzewania, potem spada z wiekiem (tak jak GFR) • Czynniki mające wpływ na poziom kreatyniny (wiek, płeć, rasa, masa ciała, dieta, leki) • Przedział wartości referencyjnych nie koreluje dobrze z wczesną chorobą nerek

21. Nieprawidłowe wyniki stężenia kreatyniny: Wzrost stężenia kreatyniny: • Bez znaczenia fizjologicznego: • - dieta bogata w mięso-intensywne ćwiczenia- wpływ leków (np. salicylany)- interferencje analityczne (np. antybiotyki, cefalosporyny) • Patologia: • - choroby nerek (dowolna przyczyna obniżonego GFR)

22. Spadek stężenia kreatyniny: • Fizjologicznie:- poród • Patologia:- spadek masy mięśni (głodzenie, choroby wyniszczające, terapia sterydowa)

23. GFR Współczynnik przesączania kłębuszkowego (GFR, z ang. glomerularfiltrationrate) • Ilość osocza przefiltrowana w jednostce czasu przez kłębuszki nerkowe do tzw. moczu pierwotnego. Zwykle podawany jest w ml/min lub w ml/(min×1,72m²) (czyli po przeliczeniu na standardową powierzchnię ciała). Współczynnik GFR pozwala na ocenę stopnia wydolności nerek. Oceniany na podstawie klirensu egzogennych lub endogennych substancji

24. Badanie GFR jest wykorzystywane do: • Wykrycia przewlekłej choroby nerek CDK • Oceny stopnia zaawansowania CDK • Ustalenia dawkowania leków wydalanych drogą przesączania kłębuszkowego • Badania innych metod terapeutycznych lub wpływu leków na funkcje nerek Czynniki wpływające na wartość GFR: • Zmienność dobowa GFR- najniższe w nocy, najwyższe rano • Długotrwała wyprostowana pozycja ciała • Ciąża • Cukrzyca • Dożylna infuzja dopaminy

25. Idealny marker GFR • Jest wydalany wyłącznie drogą przesączania kłębuszkowego • Nie wiąże się z białkami osocza i nie wnika do erytrocytów • Nie podlega wchłanianiu zwrotnemu i sekrecji w kanalikach • Nie ulega przemianom metabolicznym w ustroju • Nie jest wychwytywany przez inne tkanki • Obojętny dla ustroju i środowiska • Tani i łatwo dostępny • Istnieje prosta i dokładna metoda oznaczania

26. Metody oznaczania GFR Złoty standard: klirens nerkowy inuliny (po przesączeniu do pramoczu nie ulega reabsorpcji ani wydzielaniu w kanalikach nerkowych) klirens nerkowy lub osoczowy 51Cr-EDTA, 125 I- talaminianujobeksolu Srebrne standardy: Metoda z wyboru: • - Klirens kreatyniny z 24h zbiórki moczu Testy przesiewowe • - Obliczanie GFR na podstawie stężenia kreatyniny w surowicy Stężenie cystatyny C

27. Klirens (współczynnik oczyszczania) - objętość osocza całkowicie oczyszczonego z danej substancji w jednostce czasu. Wyraża sprawność, z jaką osocze zostaje oczyszczone z danej substancji. Markery klirensu nerkowego Endogenne Egzogenne • Inulina • Joheksol • Chromonowy EDTA • Kreatynina • Cystatyna C

28. Kreatynina jako marker GFR: • -niska czułość diagnostyczna-stężenie zależne od masy mięśniowej, jest wyższe u mężczyzn, osób młodych, rasy czarnej-jest eliminowana drogą sekrecji kanalikowej, sekrecja nasila się w miarę spadku GFR- jest degradowana w jelitach, eliminacja pozanerkowa nasila się wraz ze spadkiem GFR-metabolizm i wydzielanie cewkowe są zmieniane przez wiele leków.-stosowana rutynowo metoda Jaffe’go ma niską swoistość-duże zróżnicowanie metodyczne powoduje dużą zmienność międzylaboratoryjną

29. Obliczanie klirensu kreatyniny 1. Wzór Cockcrofta-Gaulta:

30. 2. Wzór MDRD– wzór stworzony na podstawie danych dla pacjentów z przewlekłą niewydolnością nerek (uczestników programu Modification of Diet inRenalDisease ) dla zdrowych ludzi wyraźnie niedoszacowuje GFR, natomiast znacznie lepiej od wzoru CG szacuje GFR dla bardziej zaawansowanych stadiów PChN. MDRD Sudy- 4- parametrowe oznaczenie GFR dla osób powyżej 18r.ż. -kreatynina w surowicy-wiek-płeć-rasa • GFR (ml/min/1.73m2 ) = • 186* x kreatynina (surowica) -1,154 x wiek x 0,742 (jeżeli ♀)/ x 1,210 (Afroamerykanie) ***186- dla tradycyjnych kalibratorów 175- dla kalibratorów odnoszących się do IDMS

31. Ograniczenia: • Wiek 18-70 lat, rasa biała i Afroamerykanie z GFR <90 mL/min/ 1,73m2 • - dobrze wychodzi u cukrzyków • Gorsza zgodność z mierzonym GFR dla: • - populacji szpialnej • - ostrej niewydolności nerek • - prawidłowej funkcji nerek • Walidacja obecnie udoskonalana

32. Cystatyna C • Lizosomalna proteinaza cysteinowa,produkowana we wszystkich komórkach ze stałą szybkością. • Swobodnie filtrowana przez kłębuszki, nie wydzielana przez kanaliki proksymalne, • Jej stężenie w osoczu ↑ w dysfunkcjach cewek nerkowych, • Niezależna od masy mięśniowej i diety, • marker dla GFR

33. Na jej stężenie wpływa: • -dysfunkcja tarczycy,- glikokortykoidy- prawdopodobnie również inne czynniki- wiek (↑ stężenia po 50 r.ż.), • - rasa,- płeć • Stosowana w:- pediatrii,- geriatrii,- w przypadku łagodnego upośledzenia GFR,- w warunkach braku możliwości zastosowania kreatyniny

34. Ograniczenia Cystatyny C jako markera GFR: • - małe zróżnicowanie metodyczne,- brak międzynarodowego wzorca Cystatyny C,- wysoka cena, • - wpływ różnych czynników na jej stężenie

35. Kwas moczowy • Inaczej 2,6,8-trioksypuryna • Powstaje w wyniku degradacji (oksydacji) puryn (adeniny i guaniny) w hepatocytach. Puryny z katabolizmu kwasów nukleinowych (dieta) są zamieniane bezpośrednio do kwasu moczowego. Katabolizm puryn u człowieka:Adenozyna → inozyna → hipoksantyna→ksantyna→ kwas moczowy Guanozyna→guanina→ksantyna→ kwas moczowy

36. Wartości referencyjne: • dzieci: 120- 320 µmol/l • mężczyźni: 210- 420 µmol/l • kobiety: 130-350 µmol/l

37. Zmiany poziomu kwasu moczowego we krwi Przyczyny obniżonego poziomu : - ciężki alkoholizm, połączony z chorobami wątroby-niedobór oksydazy ksantyny- wysokie dawki salicylanów i witaminy C-Allopurinol- kortykosterydy- choroba Fanconi’ego- galaktozemia

38. Przyczyny podwyższonego poziomu krwi: - wzrost spożycia (dieta mięsna)- fizjologiczne -wzrost produkcji moczanów: Dna moczanowa, leczenie chorób mieloproliferacyjnych cytotoksycznymi lekami -obniżone wydalania: kwasica mleczanowa, choroby spichrzowania glikogenu typu, podawanie leków, zatrucia np. ołów, alkohol - defekty enzymatyczne: choroba Lesh- Nyhan

39. Zdrowy człowiek wytwarza 0,4g nukleozydów purynowych i przyjmuje z dietą dodatkowe 0,3g dziennie.Pacjenci z artretyzmem i zespołem odkładania się moczanów w tkankach mogą mieć pulę nukleozydów purynowyh rzędu 19-30g. Zasady purynowe mogą też wchodzić w reakcję odtwarzania nukleotydów purynowych. • Kwas moczowy jest eliminowany z organizmu przez: • przewód pokarmowy- 30%, • nerki-70% (filtracja, reabsorbcja, wydzielanie; w rezultacie cewka wydziela 6- 12% przefiltrowanego kwasu moczowego) Wydalanie z moczem: 250-270 mg/ dzień Jego stężenie w surowicy zależy od wielkości filtracji kłębuszkowej, z tego względu może służyć do monitorowania funkcji nerek.

40. pHmoczu >5,57 ↓ pHmoczu Kwas moczowy zdysocjowany, stosunkowo dobrze rozpuszczalny Kwas moczowy w formie niezdysocjowanej o gorszej rozpuszczalności. ↓ reabsorpcji moczanów w cewkach moczowych → wytrącania się kryształów i tworzenia kamieni moczowych.

41. Zmiany ilości wydalanego kwasu moczowego Hiperurykemia: -niewydolność nerek,-dna moczanowa, -nadprodukcja puryn (zespoły mieloproliferacyjne, masywny rozpad tkanki nowotworowej podczas chemioterapii),-specyficzne defekty enzymatyczne (np. choroba Lesch- Nyhana), -leki (diuretyki, salicylany, etambutol, pirazynamid),-zatrucie ołowiem i alkoholem,-niedoczynność tarczycy,-nadczynność przytarczyc,-kwasica mleczanowa

42. Artretyzm (podagra, dna moczanowa) krystalizacja kryształków moczanu sodowego w płynach z jam ciała np. stawowych i depozyty kryszałków w tkankach otaczających staw. W cięższych przypadkach następuje dalsze wytrącanie kryształków w tkankach miękkich. Depozyty te mogą być powodem rozwijającego się stanu zapalnego (nacieki leukocytarne). Zaburzenia nerek:-depozyty moczanów w parenchymie- depozyty kryształków moczanowych w cewkach i moczowodach→ kamica moczanowa Dna może być:-pierwotna (zwykle związana z nadprodukcją kwasu moczowego)-wtórna (niedostateczne wydalanie kwasu moczowego w chorobach nerek, wpływ leków, kwasów organicznych itp.).

43. Wrodzony defekt- choroba Lesh- Nyhana • Jest spowodowana zablokowaniem drogi powrotnego przekształcania zasad purynowych w nukleotydy powoduje opóźnienia w rozwoju umysłowym, dysfunkcję ruchową, zaburzenia neurologiczne związane z wysokim poziomem kwasu moczowego we krwi.

44. Hipourykemia: - stosowanie niektórych leków (wysokie dawki salicylanów, witaminy C),- ciężki alkoholizm, schorzenia wątroby,- zespół Fanconiego (upośledzenie reabsorpcji przez komórki kanalików nerkowych),-chemioterapia z użyciem inhibitorów syntezy puryn (6-merkaptopuryna),- allopurinol (hamuje oksydazę)- kortykosterydy,- galaktozemia.

45. Metody oznaczania kwasu moczowego: • Z kwasem fosfomolibdenowym: • Etapem wstępnym jest odbiałczanie próbki (kwas fosfomolibdenowy powodowałby wytrącenie się białka z roztworu). Odbiałczanie prowadzi się mieszaniną siarczanu cynku- wodorotlenek baru. • Do supernatantu dodaje się kwasu fosfomolibdenowego który ulega redukcji do błękitu molibdenowego przez kwas moczowy w środowisku zasadowym (odczyt 650- 700nm). Z metodą interferują: • glukoza, • kwas askorbinowy, • glutation, • cysteina, • leki (acetaminofenon, kwas acetylosalicylowy i pochodne), • inne puryny (teobromina, kofeina, teofilina).

46. urikaza Kwas moczowy alantoina + H2O2 + CO2 • (odczyt 293 nm) • Oznaczanie powstałęgo nadtlenku wodoru:H2O2+ DHBS + 4- aminofenazon→ pochodna benzochinonoiminy (czerwona) (520nm)(DHBS= 3,5- dichloro-2-hydroksy- benzenosulfonian) • Inne metody oznaczania powstałego nadtlenku wodoru: peroksydaza substrat + H2O2 barwny produkt Zakresy wartości referencyjnych kwasu moczowego zależą od metody, wartości te dla metod oznaczania kwasu moczowego z kwasem fosforowolframowym są wyższe.

47. Amoniak Amoniak syntetyzowany jest we wszystkich organach, głównie powstaje w przewodzie pokarmowym: • Degradacja aminokwasów • Utlenianie aminokwasów • Hydroliza glutaminy i asparaginy • W żyle wrotnej stężenie amoniaku jest 5- 10 razy wyższe niż w krążeniu ogólnym. W normalnych warunkach amoniak ulega przemianie do mocznika, bo jest toksyczny dla OUN (amoniak pasywnie pokonuje barierę krew- mózg). W fizjologicznym pH występuje jako NH4+.

48. Amoniak jest neurotoksyczny! → przechodzi przez barierę krew-mózg Wartości prawidłowe: 16-65 µmol/l, (noworodki 100 µmol/l)nieprawidłowy amoniak -> dysfunkcje metaboliczne Znaczenie kliniczne: Zaburzenie syntezy mocznika:-nabyte (np.: ciężkie schorzenia wątroby, choroba Reya-> podwyższony amoniak u noworodków (500- 1000 umol/l), marskość),-genetyczne (defekt jednego z enzymów cyklu mocznikowego)

49. Hiperamonemia: • Wrodzone defekty metaboliczne enzymów z cyklu mocznikowego • Wrodzone defekty metabolizmu lizyny i ornityny • Wrodzony defekt metabolizmu kwasów organicznych- propionowego, metylomalonowego, izowalerianowego itd. • WZW • Toksyczne zapalenie wątroby • Marskość wątroby • Encefalopatia przebiegu marskości (dodatkowo krwawienie do przewodu pokarmowego powoduje degradację białek krwi z wytworzeniem amoniaku lub dieta wysokobiałkowa) Nefropatia powoduje ↑ poziomu mocznika we krwi, wydzielanie do światła jelita, rozkład do amoniaku

50. Oznaczanie amoniaku 1.Błędy przedlaboratoryjne: • Palenie papierosów podnosi poziom amoniaku- 1 papieros wypalony 1h przed pobranie materiału podwyższa o 100% poziom amoniaku • Atmosfera laboratorium powinna być wolna od oparów amoniaku i dymu papierosowego. • Osocze krwi jest materiałem z wyboru (w surowicy poziom amoniaku jest wyższy) • Zahamowanie katabolizmu aminokwasów przez natychmiastowe ochłodzenie próbki krwi w lodzie, szybkie wirowanie krwi. • Pobieranie krwi na skrzep • Pobieranie krwi na antykoagulant