Sylwia Studnicka III rok OAM Gr A/B

1. ANALITYCZNE ASPEKTY OZNACZENIA ENZYMÓW I ICH PRZYDATNOŚĆ DIAGNOSTYCZNA. PROBLEMY ANALITYCZNE OZNACZANIA BILIRUBINY Sylwia Studnicka III rok OAM Gr A/B

2. ENZYMY • Enzymy są to w większości białka, zdolne do katalizowania reakcji, w wyniku której następuje przekształcenie substratów w produkty poprzez obniżenie energii aktywacji tej reakcji.

3. Podział enzymów Ze względu na sposób przedostawania się do przestrzeni pozakomórkowych: • Enzymy sekrecyjne: - powstają w narządach miąższowych i wydzielane są do krwi, gdzie pełnią prawidłowe funkcje; - obniżenie ich aktywności w surowicy = zaburzenia danego narządu. • Enzymy ekskrecyjne: - syntetyzowane są przez komórki narządów wydzielniczych i zostają wydzielone do śliny, do światła przewodu pokarmowego, itp. - występowanie ich w surowicy wynika z przeszkód w odpływie płynów wydzielniczych (żółci, soku trzustkowego). • Enzymy wskaźnikowe: - nie występują w prawidłowej surowicy lub aktywność ich jest niewielka w porównaniu z aktywnością wewnątrz komórek; - dostają się do krążenia wskutek uszkodzenia komórek.

4. Podział enzymów

5. Izoformy Są to odmienne fizycznie postacie enzymu, powstające w wyniku jego modyfikacji potranslacyjnej: • zmiana fosforylacji • asocjacja z innymi białkami, agregacja • zmiana bocznego łańcucha węglowodanowego • częściowe rozszczepienie łańcucha • deaminacja • acylacja • utlenienie gr. SH

6. Izoenzymy (izozymy) • Fizycznie różniące się postacie danego enzymu, kodowane w DNA. • Katalizuję tę samą reakcję, ale występują między nimi różnice w: - wrażliwości na temperaturę - powinowactwie do substratu- właściwościach immunologicznych- ruchliwości elektroforetycznej • przykłady izoenzymów: - dehydrogenaza mleczanowa (LDH) -kinaza kreatynowa (CK)

7. Standaryzacja metod • Ochrona enzymu przed inaktywacją termiczną, degradacją proteolityczną, utlenianiem; • bufor testowy powinien chronić enzym przed hamowaniem nadmiarem produktu; • pomiar aktywności należy wykonywać w temperaturze 37°C; • zakres roboczy metody powinien odpowiadać zakresowi mierzonej aktywności; • możliwość porównywania wyników;

8. Standaryzacja metod • Stworzenie standardów metodycznych przez Międzynarodową Federację Chemii Klinicznej – standardy IFCC; określenie wartości referencyjnych • Ujednolicenie jednostek aktywności enzymatycznej: • Jednostka międzynarodowa – IU –ilość enzymu przekształcająca 1 mikromol substratu w ciągu 1 minuty • Katal– kat –ilość moli substratu przekształcanego w produkt w czasie 1 sekundy przez 1 litr badanej próbki

9. Diagnostyka Przyczyny zmian aktywności lub stężenia enzymów w surowicy: • proliferacja komórek; • biosynteza enzymów wewnątrzkomórkowych; • zmiana przepuszczalności błon komórkowych; • nasilony rozpad komórek (w wyniku procesów patologicznych); • upośledzona biosynteza enzymów sekrecyjnych w stanach ciężkich uszkodzeń narządów miąższowych; • utrudniony odpływ płynów zawierających enzymy ekskrecyjne. Zmiany te wywołane są przez: • urazy zewnętrzne → zmiażdżenie tkanki, oparzenia • urazy wewnętrzne → krwotoki • stany zapalne • procesy zwyrodnieniowe i martwicze

10. Lokalizacja enzymów w organellach komórkowych

11. Diagnostyka a lokalizacja • Ze względu na umiejscowienie enzymów w komórce, stopień uszkodzenia tkanki ma wpływ na poziom i rodzaj enzymów komórkowych w osoczu. ● Lekkie uszkodzenia komórek powodują ucieczkę do osocza białek i enzymów cytoplazmatycznych. ● W ciężkich uszkodzeniach komórek w osoczu pojawiają się enzymy mitochondrialne.

12. KINAZA KREATYNOWA (CK) – enzym wskaźnikowy • Izoenzymy: CKMM, CKMB, CKBB • w osoczu ludzi zdrowych CKMM stanowi 95% aktywności całkowitej (CKcałk) • do obniżenia aktywności CKMM dochodzi w wyniku zmniejszenia masy mięśni • oznaczanie aktywności CKcałk i CKMBcat pozwala na potwierdzenie wystąpienia zawału w ciągu pierwszej doby tylko u ok. 70% chorych; skuteczniej wykrywa się stan zawałowy we wcześniejszych etapach oznaczając izoformy sercowe białek – troponinyI oraz T oraz mioglobinę; preferuje się także oznaczenia stężenia CKMBmass

13. Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) • Izoenzymy LDH1 – LDH5 obecne są w mózgu, płucach, leukocytach, mm szkieletowych, erytrocytach, mm sercowym, płytkach krwi, nerkach, wątrobie. • Swoistą izoformą dla mięśnia sercowego jest LDH1 , o długim okresie półtrwania (ok. 100 godzin); specyficzna dla wątroby – LDH5 ma krótki czas półtrwania (do 10 godzin). • W osoczu osób zdrowych dominuje izoenzym LDH2.

14. FOSFATAZA ZASADOWA (ALP) – enzym wskaźnikowy/ekskrecyjny • Trzy izoenzymy, niespecyficzne tkankowo, kodowane są przez jeden gen – w wątrobie, tkance kostnej i nerkach. • Trzy izoenzymy – jelitowy, łożyskowy i komórek zarodkowych kodowane są przez 3 geny swoiste tkankowo.

15. FOSFATAZA KWAŚNA (ACP) – enzym wskaźnikowy/ekskrecyjny • Izoenzymy: wątrobowy, nerek, stercza, kostny oraz izoformy izoenzymu kostnego wytwarzane w neutrofilach, erytrocytach, płytkach krwi, śledzionie. • U dzieci w okresie pokwitania aktywność ACP jest 2-5 razy wyższa, niż u dorosłych. • U dorosłych zdrowych mężczyzn ok. 30% aktywności całkowitej ACP stanowi aktywność izoenzymu stercza.

16. AMINOTRANSFERAZA ASPARAGINIANOWAAMINOTRANSFERAZA ALANINOWA AMINOTRANSFERAZA ASPARAGINIANOWA – AST, enzym wskaźnikowy • zlokalizowana jest w cytoplazmie i mitochondriach komórek wątroby, mięśni szkieletowych i serca, w erytrocytach, komórkach kanalików nerkowych • ma znaczenie w diagnostyce schorzeń wątroby AMINOTRANSFERAZA ALANINOWA – ALT, enzym wskaźnikowy • ALT występuje wyłącznie w cytoplazmie (w komórkach wątroby i nerek wyższy poziom; niższy – w mięśniach; w niewielkich ilościach obecna w komórkach wszystkich innych tkanek). • ALT jest względnie swoista dla hepatocytów • dogodny test skriningowy do wykrywania stanów zapalnych wątroby (zakażenie HBV, HCV, alkoholizm, leki hepatotoksyczne) • Aktywność AST i ALT w prawidłowej surowicy jest nieco wyższa u mężczyzn, niż u kobiet; u noworodków jest większa 1,5- 2 razy, niż u dorosłych.

17. AMINOTRANSFERAZA ASPARAGINIANOWAAMINOTRANSFERAZA ALANINOWA

18. DEHYDROGENAZA GLUTAMINIANOWA – GLDH, enzym wskaźnikowy • enzym zlokalizowany w mitochondriach wątroby

19. GAMMA-GLUTAMYLOTRANSFERAZA – GGT, enzym wskaźnikowy/ekskrecyjny • enzym zlokalizowany w błonach komórek o aktywnym transporcie aminokwasów - nabłonku wątroby, trzustki, jelita dróg żółciowych, kanalików nerkowych • GGT obecna we krwi pochodzi głównie z wątroby • aktywność w prawidłowej surowicy u kobiet nieco niższa, niż u mężczyzn; duża aktywność u noworodków i niemowląt w pierwszych miesiącach życia

20. GAMMA-GLUTAMYLOTRANSFERAZA – GGT, enzym wskaźnikowy/ekskrecyjny • zmiany aktywności GGT wyraźnie korelują ze zmianami aktywności ALP • enzym podlega indukcji przez barbiturany, fenytoinę, estrogeny, spożywany alkohol

21. ALFA-AMYLAZA – AMS, enzym ekskrecyjny • W surowicy obecnych jest 8 izoenzymów pochodzących z trzustki, ślinianek, błony, śluzowej jelita cienkiego, gruczołów mlecznych, jajników, jąder • Diagnostycznie wykorzystuje się oznacznie aktywności całkowitej lub izoenzymu trzustkowego w surowicy i moczu w chorobach trzustki i przewodu pokarmowego • AMS jest białkiem małocząsteczkowym – podlega przesączaniu do moczu (białkomocz przednerkowy) i jest dobrym odzwierciedleniem poziomu we krwi; oznaczanie AMS w moczu może być dogodne w monitorowaniu schorzeń trzustki.

22. ALFA-AMYLAZA – AMS, enzym ekskrecyjny

23. LIPAZA TRZUSTKOWA – LP, enzym ekskrecyjny • enzym wytwarzany głównie w trzustce • zmiany aktywności LP mogą być wywołane przez leki: - heparyna, kodeina, opioidowe leki przeciwbólowe zwiększają aktywność LP - chinina hamuje aktywność LP • wzrost aktywności LP w ostrym zapaleniu trzustki utrzymuje się dłużej, niż aktywności AMS • ze względu na swoistość narządową wzrost aktywności LP charakteryzuje się prawie 100% czułością w rozpoznawaniu OZT.

24. ELASTAZA1– enzym sekrecyjny trzustki • Enzym nie ulega rozkładowi w jelicie cienkim i grubym, zawartość oznaczana w ekstrakcie próbki stolca odzwierciedla poziom elastazy wydzielanej do dwunastnicy. • Duży spadek zawartości elastazy 1 poniżej normy wskazuje na ciężką niewydolność zewnątrzwydzielniczą trzustki.

25. CHOLINESTERAZA – ChE, enzym sekrecyjny wątroby • enzym wydzielany z wątroby do krążenia • do tej grupy należy AChE (rozkład acetylocholiny) – acetylocholinesteraza w komórkach układu nerwowego, w erytrocytach, płucach • Znaczna zmienność międzyosobnicza aktywności ChE ogranicza jej przydatność jako pojedynczego testu w rozpoznawaniu uszkodzenia wątroby

26. CHOLINESTERAZA – ChE, enzym sekrecyjny wątroby • ChEjest użyteczna w monitorowaniu przewlekłych chorób wątroby

27. Inne enzymy sekrecyjne • Lipaza lipoproteinowa – różnicowanie zaburzeń gospodarki lipoproteinowej. • Enzymy krzepnięcia i fibrynolizy – czynniki II, V, VII, IX, X: pomiar czasu protrombinowegojest miarą ich stężenia w surowicy. • Ceruloplazmina– gromadzenie jonów miedzi w wątrobie wywołuje spadek poziomu ceruloplazminy w osoczu.

28. Izoenzymy jako markery chorób nowotworowych • Wykrywane są częściej w stadiach zaawansowanych, niż we wczesnych etapach, • Monitorowanie ich aktywności w surowicy pozwala na ocenę skuteczności terapii oraz na wczesne wykrycie nawrotu choroby. Przykłady: • Enolaza– enzym glikolityczny • ALP • ACP - Wzrasta aktywność u ok. 50% chorych z zaawansowanym rakiem stercza.

29. Izoenzymy jako markery chorób nowotworowych • GGT – wzrost aktywności w nowotworach wątroby, zwłaszcza z towarzyszącą cholestazą. • LDH • PSA (prostatespecific antygen) – proteza serynowa wydzielana przez komórki nabłonkowe kanalików zdrowego stercza, ale również przez nabłonek gruczolakoraka i raka stercza.

30. Bilirubina • Pomarańczowoczerwony barwnik żółciowy, będący produktem rozpadu hemu hemoglobiny i innych hemoprotein • Bilirubina słabo rozpuszcza się w wodzie, dlatego w osoczu krwi transportowana jest w połączeniu z albuminą • Frakcja bilirubiny nietrwale związanej z albuminami nazywana jest bilirubiną wolną lub pośrednią. Bilirubina wolna nie przedostaje się do moczu, ale może przenikać przez barierę krew-mózg

31. Bilirubina • Bilirubina wolna transportowana jest do wątroby, gdzie następują jej dalsze przemiany do rozpuszczalnej w wodzie bilirubiny związanej (bezpośredniej), przez co traci zdolność przenikania przez barierę krew-mózg i traci właściwości neurotoksyczne • UDP-glukuronozylotransferazasprzęga bilirubinę z kwasem glukuronowym (glukuronianem) • Bilirubina związana wydzielana jest aktywnie do żółci, skąd dalej trafia do jelita. Jest tam przekształcana w barwniki żółciowe – urobilinogeny (sterkobilinogeny) przy udziale enzymów bakteryjnych

32. Właściwości bilirubiny • Bilirubina jest związkiem wrażliwym na działanie światła naturalnego i sztucznego. W czasie ekspozycji na światło dochodzi do jej izomeryzacji i utleniania • W diagnostyce laboratoryjnej ekspozycja na światło może wpłynąć na wynik oznaczania bilirubiny, zaniżając jej stężenie, jeśli próbka nie była chroniona przed światłem

33. Hiperbilirubinemia • Może być spowodowana upośledzeniem sprzęgania bilirubiny w wątrobie lub zaczopowaniem przewodów żółciowych, a także wytwarzaniem większej ilości bilirubiny niż jest w stanie wydzielić do przewodów żółciowych prawidłowo funkcjonująca wątroba. Przy stężeniu bilirubiny w osoczu przekraczającym 2-2,5 mg/100 cm3 dyfunduje ona do tkanek dając obraz kliniczny określany mianem żółtaczki. • Przyczyną podwyższonego stężenia bilirubiny przedwątrobowej może być też niedokrwistość hemolityczna, a także dziedziczne zaburzenia sprzęgania bilirubiny w wątrobie.

34. Hiperbilirubinemia • Podwyższony poziom bilirubiny wolnej może być też spowodowany uszkodzeniem miąższu wątroby, powstałym w następstwie: WZW, marskości wątroby, zatruć, długotrwałego stosowania hepatotoksycznych leków, czemu towarzyszy upośledzenie wydzielania do żółci sprzężonej bilirubiny. • Hiperbilirubinemia spowodowana wzrostem stężenia bilirubiny sprzężonej wiąże się z obecnością bilirubiny w moczu (bilirubinuria), podczas gdy wolna bilirubina (skompleksowana z albuminą) nigdy nie pojawia się w moczu.

35. Bilirubina jako marker w diagnostyce laboratoryjnej • U zdrowych ludzi stężenie bilirubiny wynosi 1 - 1,3 mg/dl (17,1 - 22,2 μmol/l). • Stężenie to jest fizjologicznie wyższe u dzieci do 1 miesiąca życia, zwłaszcza u wcześniaków, u których prawidłowe stężenie może sięgać nawet do 16 mg/dl (273,6 μmol/l) w 3-5 dniu życia • Podwyższone stężenie bilirubiny określa się jako hiperbilirubinemię. U chorych bilirubina sprzężona może przenikać do moczu. Taki stan nazywa się cholurią

36. Metody oznaczania bilirubiny • WYSOKOSPRAWNA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA (HPLC) pozwala rozdzielić bilirubinę na 4 frakcje: – alfa– frakcja bilirubiny wolnej – beta – frakcja bilirubiny sprzężonej (monoglukuronid bilirubiny) – gamma– frakcja bilirubiny sprzężonej (diglukuronid bilirubiny) – delta– frakcja bilirubiny sprzężonej, związanej kowalencyjnie z albuminami; nie występuje u osób zdrowych i pojawia się przy wysokich, utrzymujących się stężeniach bilirubiny sprzężonej; utrzymuje się we krwi ok. 2 tygodni Metoda HPLC nie ma szerokiego zastosowania w rutynowej diagnostyce.

37. Metody oznaczania bilirubiny • REAKCJA EHRLICHA – reakcja, w której dwuazowy kwas sulfanilowy reaguje z bilirubiną, w wyniku czego powstają dwa barwne izomery (w pH obojętnym obserwujemy kolor purpurowy, w pHkwaśnym lub zasadowym obserwujemy kolor niebieski)

38. Metody oznaczania bilirubiny • METODA JENDRASSIKA–GROFA (zmodyfikowana) – wykorzystywana do bezpośredniego oznaczania bilirubiny wolnej i sprzężonej – dokonuje się dwukrotnie pomiaru kolorometrycznego przy dwóch długościach fali – 400 i 460 nm. – pierwszy pomiar pozwala określić stężenie bilirubiny całkowitej – drugi pomiar wykorzystuje różnicę w molowej zdolności absorpcyjnej frakcji wolnej i sprzężonej

39. METODY OZNACZANIA BILIRUBINY W MOCZU • Przy użyciu testów paskowych • Bilirubina może krystalizować w moczu o kwaśnym pH, zwłaszcza po schłodzeniu, a jej kryształy są widoczne podczas analizy osadu moczu najczęściej w postaci żółto-brązowych igieł • Wyniki zaniżone: wysokie stężenie witaminy C, azotyny, ekspozycja na światło • Wyniki fałszywie dodatnie: NSLPZ

40. Bilirubinometr • Jest to urządzenie do nieinwazyjnego, przezskórnego pomiaru poziomu bilirubiny, również w czasie i po fototerapii noworodków. • Na pomiar nie ma wpływu płeć, rasa, wiek urodzeniowy, ani waga noworodka. • Pomiaru dokonuje się przez skierowanie białego światła w skórę noworodka i badanie intensywności powracających fal o określonej długości. • Znając spektralne właściwości składników skóry, można wydzielić składniki zakłócające i określające koncentrację bilirubiny.

41. Dziękuję za uwagę