Download
1 / 63
630 likes | 1.06k Views
AUGU PAVAIROŠANA IN VITRO KULTŪRĀS.
E N D
6.1. PavairošanaMikropavairošana ekonomiski attīstītās valstīs ir ļoti iecienīta (skat. 2.lekciju). Laboratorijas vadītājs no Häberli – P.Döbeli 1988.g. žurnālā “Der Gartenbau” publicē savas atziņas, ka sākumā valdīja uzskats, ka visu būs ļoti vienkārši pavairot lielos daudzumos. Tad nāca vilšanās. Daudzos gadījumos ir vajadzīga liela pacietība, lai attiecīgo taksonu vispār ieviestu kultūrā un sasniegtu pavairošanās fāzi.
6.1.2. Proliferācija • Proliferācija ir ļoti tipiska pavairošanās tieši audu kultūrās, kad no dzinuma pamatnes veidojas vairāki sāndzinumi. To var būt arī ļoti daudz. Pārstādot jaunā barotnē, šos dzinumus atdala.
Adventīvo pumpuru veidošanās Amarillis
Lai panāktu proliferāciju, barotnei pievieno citokinīnus vai arī citokinīnus un auksīnus noteiktās attiecībās. Pilnīgi noteikti nepievieno giberelīnus, jo tie nomāc sānpumpuru veidošanos un stimulē apikālo augšanu.
G.Marino un līdzautori (1993) pētījuši tos faktorus, kas ietekmē Prunus armeniaca L. pavairošanos un secinājuši, ka proliferācija bija proporcionāla BAP koncentrācijai barotnē, pie kam ar sorbitolu bija lielāks pavairošanās koeficients nekā ar saharozi.
Protams, stimulējošais efekts ir līdz noteiktai koncentrācijas robežai, aiz kuras jau sākas negatīvas organisma reakcijas. Tā, 8,8 mol.L-1 BAP jau izraisīja pārlieku ūdens koncentrāciju audos, resp., vitrifikāciju.
Dzinums Pavairošanās – proliferācija Ziedēšana!!! In vitro!!!
Kā jau minēts, tad nozīme bija ne tikai citokinīniem, bet arī cukuriem. Sorbitols gan palielināja proliferācijas koeficientu aprikozēm, gan arī veicināja labāku dzinumu augšanu garumā. Vēl vairāk, tas parādīja pozitīvu paliekošu ietekmi uz apsakņošanās paātrināšanu.
Simpozijā Somijā par in vitro kultūrām (2000.g.) bija referāts, kurā apskatīta ABS un imazolīna (IMA) pievienošana proliferācijas barotnēm. ABS, kā zināms, ir spēcīgs dabiskais inhibitors, bet autori uzskatīja, ka tā pievienošana varētu noderēt , lai regulētu pavairošanos. Respektīvi, lai neveidotos daudz, bet kroplu dzinumu. Kā zināms no pieredzes audu kultūrās, tad cenšanās pēc liela pavairošanās koeficienta noved pie vitrifikācijas vai “eža” veidošanās – audu bumbuļa ar ļoti daudzām dzinumu “adatām”, kas atdalot nav spējīgas attīstīties par normāliem dzinumiem.
6.1.3. Citas pavairošanas metodesIr arī metodes, kas ir retāk pielietotas parastajā mikropavairošanā. C.P.Valobra un D.J. James (1990) Betula pendula ‘Dalecarlica’ pavairošanai lietoja lapu diskus. Dzinumu veidošanos iniciēja ar fizioloģiski aktīvo savienojumu palīdzību. Uz ~ 80% no lapu diskiem veidojās dzinumi, ja barotnei pievienoja 45,6 mol.L-1 zeatīna.
R.J. McNicol un J.Graham (1990) publicējuši datus par aveņu un kazeņu reģenerāciju kā no lapu diskiem, tā starpmezglu stumbra segmentiem kā ar, tā bez mizas. Lapu diski bija jānovieto ar apakšpusi uz augšu. Bez MS makro- un mikrosāļiem, saharozes, agara un aktīvās ogles, autori pievienojuši barotnei šādas piedevas:
Reģeneranti veidojās kā no lapu diskiem, tā arī no starpmezglu stumbra segmentiem. Noteicošie faktori bijuši –fitohormonu veidi un koncentrācija, saharozes daudzums un eksplanta stāvoklis uz barotnes.
Minētajā gadījumā vispirms veidojās primārais kalluss un tikai tad jaunie dzinumi un ja barotnei pievienoja BAP (0,2 mg.L-1) un 2,4-D. Tiesa, metodiski ļoti būtiskus momentus autori nav publicējuši.
D.D. Ellis un D.E. Bilderback (1984) ir izstrādājuši metodi pumpuru iniciācijai uz Pinus ponderosa Dougl ex Lans embriju dīgļlapu malām. Autori konstatēja, ka Cheng barotnē embrijs veido kallusu un rada atdalāmus pumpurus dīgļlapu galos. Uz pusi vājākā barotnē ar normālu hormonu devu embrijs veido mazu kallusu, kā arī pumpurus visā platībā, kur dīgļlapas saskaras ar barotni. Neveidojās neviens pumpurs, ja barotnē trūka citokinīnu, un no diviem (BAP un 2iP) citokinīniem tikai BAP bija nepieciešams vairākkārtējai pumpuru iniciācijai.
Pumpuru iniciāciju minētajā eksperimentā negatīvi ietekmēja arī IES vai ISS trūkums barotnē. Kopumā autori secināja, ka inducēto pumpuru skaits ir atkarīgs no:· no noņemto embriju ģenētiskās daudzveidības,· no tā, ka pumpuri primāri veidojas uz dīgļlapām, tām saskaroties ar barotni.Pumpuri parasti neveidojās tad, ja dīgļlapu virsma bija virs vai zem barotnes līmeņa.
Visumā šeit ir daudzu faktoru ietekme, kas ir jāpārbauda. Piemēram, vai nitrātu koncentrācija pamatbarotnē var iespaidot pumpuru veidošanos minētām priedēm.Pumpuru iniciācijai bija nepieciešams BAP, kā arī bija zināma auksīnu pēciedarbība uz iniciēto pumpuru skaitu.
6.2. Apsakņošana6.2.1. LakstaugiLakstaugi sakņojas nosacīti labāk nekā kokaugi. Klasiskās apsakņošanas metodes ir divas:· apsakņošana in vitro, pievienojot barotnei auksīnus,·sterilo dzinumu apsakņošana ex vitro substrātā ar vai bez apstrādes ar auksīniem. Apsakņošanai izmanto auksīnus IES, ISS, NES u.c. (4.lekc.).
Retāki ir gadījumi, kad ir vajadzīgi speciāli paņēmieni. K. Dimasi-Therion ar līdzautoriem veikuši izmēģinājumus ar petūnijām (Petunia hybrida L.), lai noskaidrotuetilēna(gāzveida fitohormons – inhibitors) ietekmi uz sakņošanos. Viņi konstatēja, ka etilēnam ir nozīme petūniju mikrodzinumu apsakņošanāin vitro auksīnbrīvā barotnē.
Etilēns 10 ppm koncentrācijā inducēja adventīvo sakņu veidošanos, bet zemās (0,01-1 ppm) koncentrācijās neietekmēja sakņošanos. Apstrāde ar etilēnu visefektīgākā bijusi pēc 2 nedēļu kultivēšanas.Co2+ inhibēetilēna sintēzi. Šī jona pievienošana barotnei samazināja endogēni producētā etilēna daudzumu un to pavadīja samazināta dzinumu veidošanās. Ag2+ kavēetilēna iedarbību, kā rezultātā veidojās ļoti niecīgs dzinumu skaits.
J. Pius, u.c. 1993.g., eksperimentos ar Pennisetum americanum izmantojuši gan etilēnu, gan tā inhibitorus – sudraba nitrātu, kobalta hlorīdu, niķeļa hlorīdu un O-acetilsalicilskābi, gan arī antibiotiķus – cefalotaksīmu un cefalosporīnu. Šīs vielas samazināja etilēna daudzumu kultivācijas traukos. Etilēns noteiktās devās veicina apsakņošanos, bet samazina reģenerācijas potenciālu.
Pēc D. Gertneres domām pietiek hermētiski aizvākot kultivācijas traukus ar vīnogām četras dienas, lai slēgtajā atmosfērā rastos atbilstošs etilēna daudzums, un sāktos sakņu iniciācija.
In vitro simpozijā (2000) bija ziņojums par to, ka Arabidopsis italiana sakņošanai izmantots gan auksīns(10 mol.L-1 ISS), gan dažādas koncentrācijas CaCl2, gan citokinīni, un secināts, ka optimāli bija pielietot bez minētās ISS arī 1 mol.L-1 kinetīnu un 1 mmol.L-1 CaCl2.
6.2.2. Skujkoki un lapu kokiSkujkoku sakņu veidošanos galvenokārt ietekmē auksīna koncentrācija un tā pielietošanas veids (laiks), kā arī dzinumu kvalitāte, donoraugu vecums, klons un temperatūra. Labi sazarotas sakņu sistēmas iegūšanai jāizmanto substrāti ar labāku aerāciju kā agaram. Aklimatizācijas procesā skujkokiem nepieciešams liels mitrums, kaut arī skuju kutikulas dēļ tie ir izturīgāki pret ūdens trūkumu.
Skujkokiem audu kultūrās spontānas apsakņošanās procents svārstās starp 1% un 5%; izņēmums ir priede – 36%. Apsakņošanās galvenokārt tiek veikta in vitro, mazāk – in vivo.In vitro parasti lieto agarizētas barotnes. To priekšrocības – vienmērīga auksīnu un barības vielu piegāde, labs kontakts starp saknēm un substrātu.
Citos substrātos (kūdras, perlīta, vermikulīta, smilts maisījumi) ir grūti vienmēr uzturēt mitrumu un saglabāt veselīgus dzinumus, taču bieži vien agarā veidojušās saknes nav funkcionēt spējīgas (Mohamed, Vidaver, 1988). Agars traucē gāzu apmaiņu, inhibē sakņu vaskulārās sistēmas attīstību un spurgaliņu veidošanos. Kā caurlaidīgus minētie autori iesaka kūdras, perlīta un kūdras : vermikulīta maisījumus.
Sakņu iniciācijaBarības elementu koncentrācija skujkokiem parasti tiek samazināta uz pusi, literatūrā aprakstīta saharozes koncentrācija 5 g.L-1, parasti 10-20 g.L-1. Bioķīmiski sakņu iniciācija ir augsti enerģētisks process, kam nepieciešama nepārtraukta ilgstoša brīvo cukuru piegāde no barotnes. 40 g saharozes uz 1 litru ievērojami palielināja stumbru lignifikāciju un veicināja aklimatizāciju.
Saharoze tiek labi asimilēta, tā kalpo enerģijas ieguvei un šūnu komponentu veidošanai, kā arī tā ir osmotiskais aģents – tādēļ tās koncentrācijas pazemināšana būtu nevēlama. Nav bijis arī novērots, ka saharozes koncentrācijas pazemināšana palīdzētu augiem pāriet no heterotrofas uz autotrofu barošanos.
FirohormoniParasti barotnei tiek pievienotas NES vai ISS. NES, ISS vai IES kombinācijas ir efektīgas dažām kultūrām, kā norvēģu eglei, duglāzijai. Auksīnu veids ietekmē kallusa veidošanos pie dzinumu pamatnes un sakņu skaitu. Piemēram, duglāzijai IES pievienošana barotnei deva 1-2 saknes un maz kallusa; Pinus radiata – ISS nepieciešama pirmās 4 apsakņošanas dienas, - giberelskābe pirmās 4 dienas ir inhibējoša, bet vēlama no 4. – 6. dienai.
NES lieto mazās koncentrācijās – 0,05-0,5 mg.L-1 (ppm). Lielākas koncentrācijas izraisa pastiprinātu kallusa veidošanos, var samazināt sakņu skaitu. ISS lietojamās koncentrācijas ir 1-10 ppm, IES – 10-20 ppm. Augstākas to koncentrācijas lieto pulsējošai ekspozīcijai.
Ja duglāzijai mātesauga vecums bijis 6 mēneši līdz 4 gadi, auksīni nepieciešami 2-5 reizes vairāk kā tad, ja donoraugi jaunāki par 6 mēnešiem. MS barotnē IES ir relatīvi nestabila. Nedēļas laikā barotnē ar ½ no MS pamatsāļiem IES koncentrācija samazinās par 40%, kurpretim NES ir nemainīga 35 dienas.
Apsakņošanās hormonus var pievadīt 3 veidos (Mohamed, Vidaver, 1988): • nepārtraukta ievadīšana barotnē, • īslaicīga impulsa veidā, • ar apsakņošanās pulveri.
Visefektīgākā skujkokiem ir bijusi impulsa veida auksīnu pievadīšana. Dzinumus pakļauj augstai auksīna koncentrācijai (šķīdumā agarā vai vermikulītā). Impulss ilgst no 12 stundām līdz vairākām dienām ar sekojošu pārvietošanu uz bezauksīnu barotnes. Viens no efektīgākiem veidiem, kā realizēt fitohormonu impulsveida pievadīšanu, ir lietot tādu formu, ko augs uzreiz iesaista metabolismā, tiklīdz tas ir veicis ierosinošo darbību un nekavē tālāku attīstību.
Auksīnu ietekmi bieži palielina apsakņošanās “kofaktoru” jeb auksīnu sinergistu klātbūtne, daži no kuriem, iespējams, ir fenoli. Apsēm D2, D3 vitamīni un dihidrotahisterols 10-50 ppm koncentrācijā veicināja sakņošanos, īpaši klātesot 10 ppm ISS.
Un, tāpat kā lakstaugiem, arī kokiem zinātnieki pētījuši etilēna lomu apsakņošanā. Tā, A. Gonzalez, R. Rodriguez un R.S. Tames (1993) publicējuši sakņošanas eksperimentus ar lazdāmCorylus avellana L. cv. Casina un secinājuši, ka ievainojuma inducēts etilēns ir svarīgs stimulējošs faktors sakņu aizmetņu veidošanai un ir pierādīts, ka etilēns var kontrolēt lazdu dzinumu sakņošanos, inducējot jaunus izozīmus ar peroksidāzes un polifenoloksidāzes aktivitāti.
No reālās pieredzes Nacionālā botāniskā dārzā ar dažiem augu taksoniem ir zināms, ka ir tādi augi, kas necieš eksogēni pievadītus auksīnus, tāpat kā ir tādi, kas vairāk vai mazāk cieš no citokinīniem barotnē. Ja kultūra “nemīl” auksīnus, to grūti apsakņot. Bet ir gadījumi, ka izdevies iegūt saknes, ja pielietoja ~0,3 mg.L-1 (10-6 mol.L-1) citokinīnu BAP.
A.M.Vieitez, C.Sanchez un C.San-Jose (1989), pētot lapu koku apsakņošanos in vitro, sastapušies ar apikālām dzinumu nekrozēm. Dažās kultūrās apikālo dominanci pārņem viens no laterāliem pumpuriem un parasti tas, kas tuvāks apeksam, un augs paliek dzīvs. Autori ir mēģinājuši novērst nekrozes, pievienojot apsakņošanās barotnēm zemas koncentrācijas BAP. Kad nekrozes lielā mērā bija izdevies novērst, apsakņošanās procents kastaņiem un ozoliem ievērojami kritās.
Dzinuma galotnes nogriešana un griezuma vietas aplikācija ar mikropipetes palīdzību, uzpilinot 25 ppm BAP agarā, inducēja laterālo augšanu. Šķīdumu sajauca ar agaru (10 g.L-1) tādēļ, lai būtu drošāk, ka piliens noturētos. Optimālais laiks galotnes nogriešanai un apstrādei ar BAP bijis 10 dienas pēc iestādīšanas apsakņošanās barotnē. Tas uzvedina uz domām, ka dzinumu galotnes nekrozi izraisa auksīns, ko pievieno apsakņošanās barotnei sakņu inducēšanai.
Vairāki autori uzskata, ka apikālās nekrozes in vitro izraisa • kalcija deficīts, • citokinīnu trūkums, • auksīna klātbūtne. Apsakņošanos ietekmē vēl arī citi faktori.
Apgaismojums un temperatūra • Šie faktori ietekmē apsakņošanos pastarpināti – kontrolējot auksīnu aktivitāti. • Optimālā temperatūra plūmēm pēc Nacionālā botāniskā dārza Augu audu kultūru laboratorijas novērojumiem ir precīzi 21C. Ja temperatūra tikai nedaudz atšķiras, audziņi nesakņojās. • Pēc literatūras datiem skujkokiem labākā temperatūra dienā ir 20C, bet naktī – 18C. Augstāka temperatūra stimulē neorganizētu šūnu proliferāciju – var pārmērīgi attīstīties kalluss.
Par gaismas ietekmi publicē H.A. Fuernkranz, C.A. Nowak un C.A.Maynard (1990), strādājot ar Prunus serotina Ehrh. Viņu eksperimentos bijušas 3 izmēģinājumu sērijas: 1) pilna tumsa unnepārtrauktā baltā gaisma – 4 dažādas intensitātes 70 mol.m-2s-1278 mol.m-2s-1555 mol.m-2s-1833 mol.m-2s-1
1)baltā, sarkanā, dzeltenā un zilā gaisma tika testēta pēc spektra kvalitātes svarīguma2)tika pētīta zilās gaismas iedarbība (intensitāte – 7, 15, 22, 30 mol.m-2s-1).Pēc tam veikti sakņu mērījumi.
Iegūtie rezultāti parādīja, ka baltai gaismai bija negatīva ietekme uz sakņu veidošanos. 15-22 mol.m-2s-1 intensitātes zilā gaisma kavēja sakņu veidošanos, bet pilnīga inhibēšana notika, ja intensitāte bija 36 mol.m-2s-1. Dzinumi, kas bija dzeltenā gaismā, uzrādīja augstāko apsakņošanās pakāpi, sakņu skaitu uz 1 dzinuma un sakņu sauso masu.
