Krónikus toxicitás vizsgálata halivadékon

1. Krónikus toxicitás vizsgálata halivadékon OECD 215 Készítette: Czermann Mónika

2. A teszt célja • Az OECD 215-ös számú irányelv célja, hogy értékelje a vizsgálandó vegyi anyag halivadékok növekedésére gyakorolt hosszú távú hatásait. [1.]

3. A TESZT LEÍRÁSA [2.]

4. Ajánlott halfajok a teszthez • Az Európai Unión belül kifejlesztettek egy úgynevezett „gyűrűs tesztet” szivárványos pisztrángok ivadékaira (Oncorhynchus mykiss) átfolyásos rendszerben. • A szivárványos pisztráng a leginkább javasolt faj erre a tesztre. [3.] Szivárványos pisztráng (Oncorhynchus mykiss)

5. Más, jól dokumentált fajok is használhatók, de ekkor a vizsgálati eljárást esetlegesen módosítani kell, hogy a megfelelő feltételeket biztosítani tudjuk. • Ilyen fajok; • zebra dánió/zebrahal (Danio rerio) • medaka (Oryzias latipes) [4.] [5.] Zebra dánió/zebrahal (Danio rerio) Medaka(Oryzias latipes)

6. Halivadékok tartása • A teszthez használt halegyedeket egyetlen állomány populációjából kell kiválasztani, lehetőleg ugyanabból az ívásból. • A halivadékokat a teszt megkezdése előtt 2 hétig a tesztnél alkalmazott minőségű vízben és megvilágításban kell tartani. • csak azt a populációt használhatjuk fel a teszthez, melynek halálozási arány kisebb, mint a populáció 5%-a • A vizsgálatot megelőző 2 hetes felkészítés során, illetve a vizsgálat teljes időtartama alatt a halivadékok nem kaphatnak semmiféle kezelést betegség esetén.

7. A vizsgálandó vegyi anyag tulajdonságai • Ismerni kell a vizsgálandó vegyi anyag; • vízoldhatóságát • gőznyomását • egy megbízható analitikai módszert a vegyi anyag mennyiségi meghatározásához • Hasznos információk közé tartozik a vegyi anyag; • szerkezeti képlete • tisztasága • stabilitása vízben és fényben • disszociációs állandói (pKa, Pow ) • biológiai bonthatósága [6.]

8. Oldat készítése • A megfelelő koncentrációjú oldatok a törzsoldat hígításával készülnek. • Az oldat általában a tesztelt vegyi anyag hígító vízbe történő keverésével vagy rázásával állítható elő (pl. keverővel vagy ultrahangos berendezéssel). • Oldószerek vagy diszpergálószerek alkalmazása is szükséges lehet bizonyos esetekben a megfelelő koncentrációjú oldat elkészítéséhez. • megfelelő oldószer; aceton, etanol, metanol, dimetil-szulfoxid, dimetil-formamid, trietilénglikol • megfelelő diszpergálószer; Cremophor RH40, Tween80, metilcellulóz (0,01%-os), HCO-40

9. Ügyelni kell a biológiailag gyorsan lebomló vegyszerekre (pl. aceton) és erősen illékony vegyületekre, mert ezek bakteriális felhalmozódási problémákat okozhatnak az átfolyásos vizsgálatoknál. • Az alkalmazott diszpergálószer nem lehet hatással a halegyedek növekedésre és nem okozhat látható mellékhatásokat sem. [7.]

10. Hígító víz minősége • Minden olyan víz használható hígító víznek; • mely biztosítja a vizsgált egyedek hosszú távú kényelmes túlélést • a halivadékok növekedést mutatnak benne • A vízminőségnek a vizsgálat alatt állandónak kell lennie. • A hígító vízből meghatározott időközönként (pl. 3 havonta) mintát kell venni a következő komponensek ellenőrzésére; • lebegő szilárd anyagok • összes szerves szén • peszticidek • nehézfémek (pl. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni) • főbb anionok és kationok (pl. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4) [8.]

11. Az elfogadható hígító víz néhány kémiai jellemzője a táblázatban látható;

12. Teszthez szükséges készülékek • A következő készülékek szükségesek a teszt elvégzéséhez; • oxigén és pH mérő • keménység és lúgosság kimutatására alkalmas műszer • megfelelő készülék a hőmérséklet-szabályozásához, és a folyamatos megfigyeléséhez • kémiailag semleges anyagból készült tartályok (megfelelő kapacitással) • analitikai mérleg [9.] [10.]

13. A vizsgálat elve • Tömegük lemérését követően az exponenciális növekedési fázisban levő halivadékok tartályba kerülnek. • A halivadékok a vizsgálandó, vízben oldott vegyi anyag különböző koncentrációinak lesznek kitéve. • Átfolyásos, vagy ha az nem lehetséges megfelelően beállított fél-statikus rendszert használjunk. • átfolyásos rendszernél a víz és a vizsgálandó oldat folyamatosan cserélődik • fél-statikus rendszernél nincs áramlás, a vizet és a vizsgált oldatot adott időközönként teljesen kicserélik (általában naponta) • A vizsgálat időtartama minimum 28 nap.

14. A halegyedeket naponta etetik. • A napi eleség mennyisége az egyes halegyedek kezdeti tömegétől függ a és 14. napot követően újraszámolható. • A kísérlet végén a halegyedek tömegét ismét lemérik. [12.] [11.]

15. A mérés végpontjának számítása • A növekedési ütemre gyakorolt hatás egy regressziós modell segítségével elemezhető. • ezáltal megbecsülhető az a koncentráció (ECx), mely egy x %-os eltérést okoz a fejlődési ütemben (ECx = hatásos koncentráció) • pl. EC10, EC20, EC30, EC50 • Az adatokat összehasonlítva a kontroll értékekkel • meghatározható az a legnagyobb koncentráció, mely megfigyelhető hatást nem okoz (NOEC) és az a legkisebb koncentráció, mely már hatást okoz (LOEC). [13.]

16. A teszt érvényessége • A teszt érvényességéhez a következő feltételeknek kell teljesülniük; • a kontrollcsoport halálozási aránya nem haladhatja meg a 10%-ot a vizsgálat végén • a kontrollcsoport halegyedeinek átlagos tömegét megfelelően meg kell növelni ahhoz, hogy a növekedési ütem minimális eltérését ki tudjuk mutatni • a „gyűrűs teszt” során megállapították, hogy a szivárványos pisztrángoknál a kontrollcsoportok halegyedeinek átlagos tömege legalább a másfélszeresére kell nőjön • az oldott oxigén koncentrációja legfeljebb a levegő telítettségi értékének 60%-a lehet • a víz hőmérséklete legfeljebb ±1°C-al térhet el a kísérleti tartályok között

17. A TESZT ELVÉGZÉSÉNEK MENETE [14.]

18. A halegyedek kiválasztása és tömegmérése • 24 órával a teszt megkezdése előtt a halállomány etetését szüneteltetni kell. • A halegyedeket véletlenszerűen kell kiválasztani. • A halivadékokat óvatosan kell kezelni, elkerülve a stresszt okozó helyzeteket és sérüléseket. • Egyszerű altatót használva megmérjük a halak nedves tömegét. • egyszerű altató lehet pl. tricain-metán-szulfonát (MS 222) 100 mg/l-es vizes oldata szódabikarbónával semlegesítve(a semlegesítés aránya 2 egység szódabikarbóna egy egység MS 222-höz)

19. A halegyedek tömegének szórásának minimálisnak kell lennie. • a középsúlytól (számtani középtől) mért ±10%-os tartományon belülre kell esnie • Azon halegyedek, melyek tömege beleesik az ajánlott tartományába (lásd a táblázatban), véletlen-szerűen szétosztjuk a vizsgálati tartályok között. • Az egyes tartályokban a halegyedek összesített nedves tömegét fel kell jegyezni.

20. Állománysűrűség • Az állománysűrűségnek megfelelőnek kell lennie a vizsgálathoz használt halegyedek számára. • ha túl nagy, akkor a túlzsúfoltság miatt stressz léphet fel, mely a növekedési ráta visszaesését okozza, illetve betegségekhez vezet • ha túl kicsi, az territoriális viselkedést eredményezhet, mely szintén befolyásolja a növekedést [15.]

21. Etetés • A halakat megfelelő mennyiségű és minőségű eleséggel kell táplálni, hogy elfogadható növekedési rátát érjünk el. • A napi adag szétosztható két egyenlő részre, és legalább 5 órás különbséggel adagolható. [16.]

22. Az adagokat minden tartály esetén a kezdeti össztömeg alapján ki lehet számítani. • a halivadékok testtömegének 4%-a (de minimum 2%-a) naponta • Amennyiben a halegyedek tömegét a vizsgálat 14. napján újra lemérik, a napi eleség adag is újraszámolható. • A tömegmérést megelőző 24 órában a halegyedek etetését fel kell függeszteni. • Kerüljük el a mikrobák elszaporodását és víz zavarossá válását. [17.] • minden nap a tartályok aljáról el kell távolítani az el nem fogyasztott eleséget és ürüléket

23. Fény és hőmérséklet • A megvilágítási időszakot, illetve a víz hőmérsékletét a vizsgált fajhoz kell igazítani.

24. Vizsgált koncentrációk • A tesztelt vegyi anyag minimum 5 koncentrációját vizsgálni kell. • a megfelelő koncentrációk kiválasztásában segítséget nyújthat a vizsgált anyag toxicitására vonatkozó előzetes adatok • A legmagasabb vizsgált koncentráció nem haladhatja meg a tesztelt anyag oldhatósági határát. • Amennyiben a törzsoldat előállításához diszpergálószerre van szükség, a végső koncentrációja nem lehet magasabb 0,1 ml/l-nél, és lehetőleg minden vizsgálati tartály esetén azonos mértékű kell legyen. [18.]

25. Kontrollok száma • A hígító víz kontrollok száma függ a vizsgálati oldattól (minimum 1). • Ha diszpergálószert is használunk, akkor ugyanannyi diszpergálószeres kontrollra van szükség, mint ahány hígító vizes kontrollunk van. • a diszpergálószeres kontrollnak a diszpergálószert a legmagasabb vizsgált koncentrációval kell tartalmaznia [19.]

26. Analitikai ellenőrzések • A tesztelés alatt, mind az átfolyásos, mind a fél-statikus vizsgálatok során a hígító és a mérgező törzsoldat áramlási sebességét naponta ellenőrizni kell. • A vizsgálat teljes időtartama során az anyag-koncentrációk értéke nem változhat több mint 10%-ot. • ha az anyagkoncentrációk várhatóan a névleges értékek20%-ba esnek, a legnagyobb és legkisebb koncentrációkat kell kielemezni • ahol a vizsgált anyag koncentrációja nem esik a névleges érték 20%-os tartományába (pl. a vizsgált anyag stabilitási adatai alapján), az összes vizsgálati koncentrációt elemezni kell

27. A vízkémiai paraméterek közül az alábbiakat kell mérni;

28. Folyamatos vizsgálatok • A halakat naponta meg kell vizsgálni a tesztelési időszakban és bármilyen külső rendellenesség (pl. vérzés, elszíneződés), vagy rendellenes magatartás feljegyzendő. • Az egyedpusztulásokat is fel kell jegyezni, majd a halegyedet a lehető leghamarabb el kell távolítani a tartályból. • az elpusztult halegyedeket nem szabad pótolni [ 20.] • az eleségmennyiséget a megváltozott helyzetnek megfelelően módosítani kell

29. A teszt befejezése • A vizsgálatot követően (28. nap után) az összes életben maradt halegyedet lemérjük, mint nedves tömeget. • egyenként, egymástól függetlenül • Csoportokban is lemérhetjük őket a tartályok segítségével (ez a praktikusabb). [ 22.] [ 21.]

30. Eredmények értékelése [ 23.]

31. Növekedési ráta • A növekedési rátát (r) többféleképpen lehet meghatározni attól függően, hogy a halegyedeket egyedenként mértük le vagy tartályokkal együtt csoportosan. • Azon tartályok esetében, melyeknél a halálozási ráta magasabb, mint 10%, a növekedési rátát nem szükséges kiszámolni. [ 24.] • Mindegyik vizsgálati koncentrációhoz fel kell tüntetni a halálozási rátát.

32. Eredmények értékelése regresszióanalízissel(koncentráció-hatás görbe) • Összefüggést teremtünk a specifikus növekedési ráta és a koncentráció között, ezáltal lehetővé téve az ECx értékek becslését. • Kiszámítjuk a tartályok átlagos specifikus növekedési rátáját (r2 értékét). • Ezzel a módszerrel számolhatunk kisebb méretű halfajok alkalmazása esetén is. • r2 = tartály átlagos specifikus növekedési rátája • w1, w2 = egy adott halegyed tömege t1 és t2 időpontokban • t1, t2 = a vizsgálati időszak eleje és vége (nap)

33. A tartályok átlagos specifikus növekedési rátáját(r2 értékeit) grafikusan ábrázoljuk a koncentrációk függvényében. • így megkapjuk a koncentráció-hatás összefüggés görbéjét, melyről leolvashatóak az ECx értékek [ 25.]

34. Eredmények értékelése varianciaanalízissel (ANOVA) • Minden vizsgált koncentráció esetében párhuzamos méréseket kell indítani. • Párhuzamos mérési sorozat esetén a NOEC és LOEC becslése a tartályok átlagos specifikus növekedési rátájának varianciaanalízisén alapszik (ANOVA). • A koncentrációkra vonatkozó átlagos növekedési rátákat (r) összemérjük a kontroll tartályokra vonatkozó átlagos növekedési rátákkal (0,05-ös szignifikancia szint mellett).

35. Ha a vizsgálat során nem indítunk párhuzamos méréseket, akkor a varianciaanalízis érzéketlenné válik. • Ebben az esetben a varianciaanalízist a halegyedekre értelmezett „látszólagosan” specifikus növekedési rátákra (r3) alapozzuk. • Minden egyes koncentráció átlagos „látszólagosan” specifikus növekedési rátáját (r3) a kontroll tartályok átlagos „látszólagosan” specifikus növekedési rátájával hasonlítjuk össze. • r2 = „látszólagosan” specifikus specifikus növekedési rátája • w1, w2 = egy adott halegyed tömege t1 és t2 időpontokban • t1, t2 = a vizsgálati időszak eleje és vége (nap)

36. Felhasznált irodalom: • OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS (215) - FishJuvenileGrowth Test

37. Képek forrása: • [1.]: http://www.geographic.hu/index.php?act=napi&rov=3&id=10233 • [2.]: http://www.welcome.city.sapporo.jp/english/sites/sakekagaku.html • [3.]: http://ucce.ucdavis.edu/datastore/datastoreview/ /showpage.cfm?surveynumber=241&usernumber=69 • [4.]: http://fishindex.blogspot.com/2009/08/zebra-danio-danio-rerio.html • [5.]: http://www.pwri.go.jp/team/suisitsu/index_e.htm • [6.]: http://www.eduport.hu/cikk.php?id=19065&PHPSESSID=kgcriugomqr • [7.]: http://www.vanderbilt.edu/vicb/DiscoveriesArchives/ /focus_on_fish.html?ID=8272 • [8.]: http://www.wellnesskozmetikum.com/szepsegapolas/ /egeszseges_ivoviz_lugos_alkalikus_ionizalt_viz/ • [9.]: http://www.labornite.hu/index.php

38. [10.]: http://www.shigen.nig.ac.jp/medaka/medakabook/ /index.php?1.1.1%20tanks%20used%20in%20Nagoya%20Univ. • [11.]: http://www.umesc.usgs.gov/aquatic/drug_research/capabilities.html • [12.]: http://www.fws.gov/ennis/information.htm • [13.]: http://blogs.clemetparks.com/rocky-river-fishing-report/2010/8/2/ /rocky-river-fishing-report-august-2010.html • [14]: http://zebrafish.med.utah.edu/facility.php • [15]: http://www.ars.usda.gov/is/AR/archive/oct10/fish1010.htm?pf=1 • [16.]: http://good-times.webshots.com/photo/2144686260089279034OXuAhn • [17.]: http://www.understandinganimalresearch.org.uk/resources/ /images_library/details/37/rainbow_trout_aquarium_7/ • [18.]: http://www.netambulancia.hu/erdekessegek?cPage=7 • [19.]: http://conservationbytes.com/2010/11/25/ /environmental-testing-to-the-test/ • [20.]: http://www.fws.gov/ennis/information.htm

39. [21.]: http://www.alohaecowas.com/talapia1.html • [22]: http://www.northernwilds.com/pages/Explore/animals/ /bile-isnt-vile-identifying-the-scent-that-lures-tr.shtml • [23.]: http://www.ars.usda.gov/is/AR/archive/oct10/fish1010.htm?pf=1 • [24.]: http://www2.seattle.gov/util/tours/CedarRiverBiodiversity/BullTrout/ /slide3.htm