1 / 24

SEMINARIS BIOQUÍMICA I

SEMINARIS BIOQUÍMICA I. Cromatografia ELECTROFORESI Tècniques d’ADN recombinant. càtode. ànode. ànode. SUPORT. càtode. ELECTROFORESI. proteïnes ADN/ARN. Tècnica de separació de molècules en funció de la seva diferent mobilitat en aplicar un camp elèctric

ronna
Download Presentation

SEMINARIS BIOQUÍMICA I

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. SEMINARIS BIOQUÍMICA I • Cromatografia • ELECTROFORESI • Tècniques d’ADN recombinant

  2. càtode ànode ànode SUPORT càtode ELECTROFORESI proteïnes ADN/ARN Tècnica de separació de molècules en funció de la seva diferent mobilitat en aplicar un camp elèctric (dependrà de la seva càrrega elèctrica) Arne Tiselius 1937 (Nobel 1948) *Molèc. (+) pol (-) o càtode * Molèc. (-) pol (+) o ànode • ELECTROFORESI LLIURE • molècules en dissolució o suspensió: poc resolutiva • ELECTROFORESI DE ZONA • SUPORT que retè les molècules: elevat poder de resolució

  3. Components: fuente de alimentación cable cátodo ánodo * Font d’alimentació muestra electrodo electrodo gel * Dos elèctrodes ànode (+) càtode (-) cubeta tampón * Cubeta muestra electrodo cátodo - * Tampó d’electroforesis * Suport electroforètic (gel) cubeta cable ánodo gel fuente de alimentación tampón EQUIP ELECTROFORÈTIC - + (E. horizontal) + (E. vertical)

  4. FACTORS QUE AFECTEN L’ELECTROFORESI 1_ Camp elèctric *Diferència de potencial: voltatge (V-volts) *Intensitat (A-amperis): flux de carrèga elèctrica depèn de V y de R (Llei d’Ohm V=RxI) *Resistència (R-ohms): determinada pel suport i tampó d’electroforesi *Temperatura: efecte Joule  refrigerants 2_ Mostra *Càrrega o densitat de càrrega: càrrega elèctrica/massa de la molècula *Tamany *Forma: formes globulars avancen més 3_ Tampó d’electroforesi *pH: determina la càrrega de les molècules generalment és lleugerament bàsic  molècules (-) *Força iònica: moderada (0.05 o 0.1 M) per a que no interfereixi 4_ Suport

  5. SUPORT ELECTROFORÈTIC • Característiques • Gel porós (entramat tridimensional intern) • Ha de permetre el pas de molècules • Material inert: NO pot estar carregat i no ha d’adsorbir les molècules de la mostra Gel porós Tipus de Suport • No restrictiu (Tipus I): Tamanyporus >>> molècules, no oposa impediment al seu pas  separació només per CÀRREGA • * Electroforesi de proteïnes: •Acetat de cel·lulosa, paper, midó, agar • Restrictiu (Tipus II): Tamanyporus ≈ molècules, oposa resistència al seu pas  separació per tamany (tamisat molecular) • * Electroforesi de proteïnes: •Separació per CÀRREGA i TAMANY • •Poliacrilamida • * Electroforesi de DNA/RNA: •Separació només per TAMANY • •Agarosa, poliacrilamida

  6. Suport NO RESTRICTIU: Tires d'acetat de cel·lulosa mostra Strip Avançament de les proteïnes - + Camp elèctric (DV) Aplicacions clíniques: eina diagnòstica (separació de proteïnes sèriques) EN ACETAT DE CEL·LULOSA: PROTEINOGRAMA Electroforesis horitzontal 1. Aplicació de la mostra 2. Electroforesi 3. Detecció mitjançant tinció: Blau de Coomassie Negre amido 4. Densitometria

  7. Equine: Inmunodeficiency + Pneumonia Equine: Chronic Hepatitis EN ACETAT DE CEL·LULOSA: PROTEINOGRAMA Feline: Feline Infectious Peritonitis Feline: Lymphosarcoma Canine: Leishmaniosis

  8. EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE) Suport RESTRICTIU: Gel de poliacrilamida * Polimerització de dos components: Acrilamida + Bisacrilamida * Variació de la concentració  variació del tamany de porus [poliacrilamida] tamany porus Electroforesi vertical 1. Preparació del gel 2. Muntatge de la cubeta 3. Aplicació de la mostra 4. Electroforesi 5. Detecció per tinció: Blau de Coomassie Sals de plata

  9. EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE) Avantatges: * Gran poder de separació per CÀRREGA i per TAMANY * Químicament inerts * Transparents (permet fer densitometria) * Estables (pH, força iònica, temperatura) * Versatilitat quant al tamany de porus i entramat uniforme Aplicacions: * Separar proteïnes * Determinar el pes molecular d’una proteïna * Separar proteïnes oligomèriques * Separar proteïnes en funció del seu pI * Separar proteïnes de mescles molt complexes * Determinar la presència d’una proteïna en concret SDS-PAGE Isoelectroenfoc Electroforesi 2D Western Blot

  10. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 44 kDa - - - - - S-S - S-S S-S - S-S - S-S S-S + SDS + DTT - - - - - - - - - - - - - - - - - 25 kDa SDS-PAGE Condicions de la PAGE: * No desnaturalitzants: separem per CÀRREGA i TAMANY  PAGE * Desnaturalitzants: separem només per TAMANY SDS-PAGE Agents desnaturalitzants: SDS (dodecilsulfat sòdic), urea, reductors (DTT, b-mercaptoetanol)... • SDS: detergent aniònic (-), dota a totes les proteïnes de càrrega (-)  totes migraran cap a l’ànode (+), separant-se només per tamany + SDS PM = 50 kDa

  11. SDS-PAGE: Determinació del pes molecular * Marcadors de pes molecular: barreja de diferents proteïnes pre-tenyides de pes molecular conegut. Permeten extrapolar el PM de les proteïnes de la mostra  la mobilitat electroforètica (distància recorreguda) d’una molècula és inversament proporcional al logaritme del seu pes molecular

  12. + + + Proteïnes migren fins la zona del gel on pH=pI de la proteïna pH 2 (àcid) AB + + AB A pH 6 0 + 0 Prot A pI=6 Prot B pI=7 B GRADIENT DE pH pH 7 0 pH 10 (bàsic) - - - ISOELECTROENFOC *Separació de proteïnes segons el seu punt isoelèctric (pI) pI és el valor de pH en què la càrrega neta de la proteïna = 0 si pH > pI: càrrega (–) si pH < pI: càrrega (+) * Gel de poliacrilamida (PAGE) amb gradient de pH.

  13. ELECTROFORESI 2D * 1a dimensió: ISOELECTROENFOC  separa per pI * 2a dimensió: SDS-PAGE  separa per PM 1ª DIMENSIÓ 2ª DIMENSIÓ

  14. ELECTROFORESI 2D

  15. 1. SDS-PAGE Electroforesi 3. Incubació amb els Anticossos 2. Transferència a membrana proteïnes proteïnes 2ari proteïna interès ENZIM 1ari Resultat SDS-PAGE Western BLOT 4. Revelat SUBSTRAT proteïna interès ENZIM LLUM PRODUCTE Proteïna d’interès Totes les proteïnes WESTERN BLOT *Detecció d’una proteïna concreta mitjançant l’ús d’anticossos específics (tècnica molt sensible) * Tècnica immunològica interacció PROTEÏNA-PROTEÏNA (Ag-Ac)

  16. Resultat SDS-PAGE Western BLOT Proteïna d’interès Totes les proteïnes WESTERN BLOT * Tècnica immunològica interacció PROTEÏNA-PROTEÏNA (Ag-Ac) * Detectar en una barreja una proteïna concreta mitjançant l’ús d’anticossos específics (tècnica molt sensible) SDS-PAGE: Tinció Blau de Coomassie WESTERN BLOT:

  17. ELECTROFORESI D’ÀCIDS NUCLEICS Suport RESTRICTIU: * Gel d’Agarosa  molècules grans (0.1-60 kpb) * Gel de Poliacrilamida  molècules petites (6-2000 pb) Electroforesi horitzontal (agarosa) o vertical (poliacrilamida) Separació només per TAMANY Densitat de càrrega igual per a totes les molècules pels grups fosfat Àcids nucleics = càrrega (-)

  18. ELECTROFORESI D’ÀCIDS NUCLEICS Aplicacions: * Separar, identificar i purificar fragments de DNA o RNA * Determinar el tamany d’un fragment de DNA * Separació de cromosomes sencers * Seqüènciació de DNA * Identificació de regions d’unió a proteïnes * Detectar la presència d’un gen (o seqüència específica de DNA) en una mostra * Determinar si s’expressa un gen específic (detecció de RNA) Gel d’agarosa Gel de poliacrilamida Southern Blot Northern Blot

  19. mostra (-) - + Camp elèctric (DV) EN GEL D’AGAROSA Suport RESTRICTIU:Gel d’agarosa Electroforesi horitzontal 1. Preparació del gel 2. Aplicació de la mostra 3. Electroforesi 4. Detecció  tinció amb Bromur d’Etidi (BrEt): s’intercala en el DNA i en irradiar-lo amb llum UV emet fluorescència

  20. mostra (-) - + Camp elèctric (DV) EN GEL D’AGAROSA Suport RESTRICTIU:Gel d’agarosa Electroforesi horitzontal 1. Preparació del gel 2. Aplicació de la mostra 3. Electroforesi 4. Detecció  tinció amb Bromur d’Etidi (BrEt): s’intercala en el DNA i en irradiar-lo amb llum UV emet fluorescència

  21. EN GEL D’AGAROSA * Determinació del tamany dels fragments  marcadors de pes molecular

  22. 1. Electroforesi en gel de agarosa 3. Hibridació amb la sonda radioactiva 2. Transferència a membrana Sonda de DNA molècules de DNA molècules de DNA 32P …TAACGT… DNA interès …ATTGCA… Resultat Gel Agarosa Southern BLOT 4. Revelat DNA interès 32P DNA d’interès Tots els DNA SOUTHERN BLOT * Detecció d’una seqüència de DNA concreta mitjançant l’ús de sondes de DNA específiques (molt sensible) * Interacció DNA-DNA (hibridació per complementarietat de cadena) * Detectar la presència d’un gen, etc.

  23. 1. Electroforesi en gel d’agarosa 3. Hibridació amb la sonda radioactiva 2. Transferència a membrana Sonda de DNA molècules de RNA molècules de RNA 32P …TAACGT… RNA interès …AUUGCA… Resultat Gel Agarosa Northern BLOT 4. Revelat RNA interès 32P RNA d’interès Tots els RNA NORTHERN BLOT * Detecció d’una seqüència de RNA concreta mitjançant l'ús de sondes de DNA específiques (molt sensible) * Interacció RNA-DNA (hibridació) * Estudi d’expressió gènica

  24. Links a simulacions d’electroforesis: - En tira d’acetat de cel·lulosa: http://sebbm.bq.ub.es/BioROM/contenido/biomodel/lab/acetato/inicio.htm - En gel de poliacrilamida http://biomodel.uah.es/lab/sds-page/inicio.htm - En gel d’agarosa: http://biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/elfo/gel_electrophoresis.swf http://biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/elfo/electrof.html

More Related