Griezumu sagatavošana caurstarojošai elektronu mikroskopijai (TEM)

1. Griezumu sagatavošana caurstarojošai elektronu mikroskopijai (TEM) Šūnu bioloģijas metodes Tūrs Selga

2. Bloku sagatavošana griešanai Bloku sagatavošana griešanai var notikt pēc bloku pilnīgas polimerizācijas. Dažkārt bloki pēc izņemšanas no termostata nav vienmērīgi sacietējuši vai polimerizējušies, perifērija liekas derīga, bet vidus vēl mīksts un lipīgs. Tādēļ ieteicams epona blokos ielietos paraugus nolikt sausā vietā, istabas temperatūrā 10 - 30 dienas ilgai papildus polimerizācijai. Pietiekoši sacietējušu bloku cieši iestiprina metāla turētējā tā, lai pētāmie audi atrastos augšpusē. 10-20 kārtīgā palielinājumā, labā apgaismojumā, var redzēt fiksēto audu detaļas.

3. Ar žileti apgriež bloku, līdzīgi kā asina zīmuli tā, lai izveidotās piramīdas virsotne saturētu pētāmo audu gabaliņu. Rūpīgi jāpārbauda, vai tā audu zona, ko paredzams griezt, atrodas piramīdas virsotnē. Ja par to rodas šaubas, var ar ultramikrotomu iegūt pusbiezu griezumu, to nolikt uz priekšmetstikliņa imersijas eļļas pilienā, pārsegt ar segstikliņu un apskatīt gaismas mikroskopā. Bloka slīpēšanai var izmantot arī dažādas papildus ierīces, bet pēdējos etapus veic ar žīleti.

4. Piramīdu var izgatavot ar kvadrātveida jeb taisnstūrveida pamatni. Jo lielāks griezums, jo bagātāku informāciju tas satur. Taču jo lielāku griezumu vēlamies iegūt, jo grūtāk to izgatavot pietiekoši plānu un vienmērīgu. Lielos griezumos gandrīz vienmēr novērojams vibrācijas efekts. LKB, un citi mūsdienu labāko marku ultramikrotomi, dod iespēju dažādi orientēt piramīdu attiecībā pret nazi un iegūt griezumus vēlamajā virzienā.

5. Epona bloks un epona bloks ar izveidotu piramīdu. Epona bloks iestiprināts turētājā.

6. Stikla naži Stikla nažus pagatavo, vai nu stiklu griežot un laužot ar LKB firmas «knifemaker» palīdzību, vai arī ar rokas stikla griežamo un platknaiblēm. Jāiegūst pareizu kvadrātu 2,5 x 2,5 centimetri un to jāpārlauž pa diognāli tā, lai izveidotos divi taisnleņķa trijstūri. Katra trijstūra viena virsotne var kalpot par griezošo virsmu, ja tā ir gluda, nesasprēgājusi ar nenosmērētu smaili. Nažus pagatavo īsi pirms griezumu izgatavošanas. Iepriekšējā dienā gatavoti naži, pat glabāti zem stikla kupola, vairs nav uzskatāmi par ideāliem. Pirms naža ievietošanas ultramikrotomā tam piestiprina «vanniņu» šķidrumam, uz kura virsmas peldēs un uzkrāsies griezumi. Nogriež leikoplasta strēmelīti un pielipina pie naža no vienas asmens puses līdz otrai. Leikoplasta malas aplīmē ar nagu laku vai parafīnu.

7. Bloka ievietošana mikrotomā

8. Stikla naži piestiprināti pie plastilīna Stikla nazis ar kabatiņu

9. Sietiņa attaukošana un atbalsta plēvītes izgatavošana • Sietiņa attaukošanu un atbalsta plēvītes izgatavošanu veic pirms griezumu pagatavošanas. • Mērglāzi pielej ar destilētu ūdeni tā, lai būtu izliekts ūdens virsmas menisks. • Priekšmetstikliņu iemērc 0,2% formvara (polivinilhlorīfds) šķīdumu dihloretānā. (0,02g/10ml) • Ar žileti apgriež plēvītes maiņas un to pakāpeniski ievieto destilētajā ūdeni tā, lai plēvīte atdalās no stikliņa un uzpeld ūdens virspusē.

10. Sietiņa iegūšana Uz šīs plēvītes ar gludāko pusi uz leju sarindo jaunus vai attaukotus vara sietiņus, tad uzliek atbilstoša izmēra papīra «plostiņu» tā, ka sietiņi atrodas starp formvara plēvīti un papīru. Ar pinceti satver plēvīti kopā ar «plostiņu» un izceļ no ūdens, to vienlaicīgi apgriežot ar plēvīti uz augšu. Tā iegūst sietiņus ar atbalsta plēvīti. Attaukotus sietiņus iegūst lietotos sietiņus 3 - 4 stundas mērcējot amonjakā vai kādā citā piemērotā šķīdinātājā, tad noskalojot ar destilētu ūdeni un žāvējot termostatā

11. Oglekļa atbalsta plēvītes pagatavošana Kodināšanas un uzputināšanas iekārta.

12. Griezumu iegūšana • Griezumu iegūšanai gaismas un elektronu mikroskopijai tiek izmantots ultramikrotoms TESLA; • Ieslēdz ultramikrotoma apgaismojumu; • Noasinātu piramīdu ievieto ultramikrotoma turētājā; • Iestiprina stikla nazi; • Ar skrūvju palīdzību noregulē naža un piramīdas smailes novietojumu; • Piepilda stikla nazi ar ūdeni tā, lai būtu redzams sudrabains ūdens meniska ieliekums, kas visās vietās pieskaras pie naža asmens; • Ieslēdz motoru un vēro piramīdas kustību; • Ar rokas skrūvi tuvina naža smaili piramīdai; • Sakrāj 10 labus griezumus.

13. Ultramikrotoms LKB 8800

14. Nepareizi sagatavots stikla nazis ar sudrabaini spīdošu ūdens menisku. Ūdens atkāpies no naža smailes, asmenis ir zāģveidīgs, nazis ir noputējis.

15. Griezumu noņemšana • Pusbiezie griezumi kuri tiek iegūti, lietojot ultramikrotoma rokas padevi un tie ir apmēram 15 µm biezi; • Izņem stikla nazi no mikrotoma; • Uz tīra priekšmetstikliņa uzpilina 1 pilienu dest. ūdens; • Nazi sagāž un strauji ar asmeni pieskaras priekšmetstikliņam; • Griezumi pārvietojas uz ūdens pilienu.

16. Preparātu krāsošana un ieslēģšana • Pilienam pievieno 1 pilienu kālija permanganāta šķīduma. Krāso līdz griezumi top gaiši brūni (apmēram 5 min). • Ar filtrpapīru atsūc krāsvielu. • Skalo ar 50% etanolu • Skalo ar 70% etanolu • Skalo ar 96% etanolu • Uzpilina vienu pilienu eponu maisījuma. • Pārsedz ar segstikliņu. • Iegūst pastāvīgos preparātus gaismas mikroskopijai. Pagaidu • preparātus izmanto parauga kvalitātes novērtēšanai un ultraplāno • griezumu ieguves procesa modificēšanai.

17. Darba uzdevumi • Noslīpēt piramīdu. • Sagatavot stikla nazi. • Ievietot nazi un piramīdu ultramikrotomā “TESLA” • Sagriezt ultraplānos griezumus. • Novērtēt ultraplāno griezumu kvalitāti.