Kalliopi Rantsiou e Luca Cocolin Facoltà di Agraria Università di Torino, Italia

1. Contributo delle metodiche biomolecolari nello studio dell’ecologia microbica di insaccati fermentati e delle dinamiche durante la fermentazione Kalliopi Rantsiou e Luca Cocolin Facoltà di Agraria Università di Torino, Italia

2. Biologia Molecolare • Studio delle basi molecolari dei processi biologici • Studio della struttura e della funzione delle macromolecole cellulari (DNA, RNA, proteine)

3. Le “pietre miliari” della Biologia Molecolare Kary Mullis, 1983 1995 2001 Watson and Crick, 1953 Mendel, 1856-63 Griffith, 1928 1972 PCR DNA, materiale ereditario Ereditarietà dei caratteri fenotipici struttura del DNA Sequenziamento genoma umano sequenziamento Haemophilus influenzae Molecular cloning

4. Dogma centrale della Biologia Molecolare Descrive il flusso di informazioni nei sistemi biologici

5. pyrosequencing

6. Impiego di metodi biomolecolari nei prodotti carnei fermentati

7. convenzionale vs. molecolare • fenotipo • variabile • interpretazione dei risultati • tempo • genotipo • costante • identificazione inequivocabile • caratterizzazione precisa

8. PCR specie-specifica • sono stati sviluppati primers per le principali specie LAB (lactic acid bacteria) e CNC (coagulase negative cocci) coinvolte nelle fermentazioni delle carni • sequenze target: 16S rDNA, frammenti random (es. profili RAPD), geni codificanti per sodA, hsp-, lipase- • identificazione di un rilevante numero diisolati attribuiti in modo presuntivo a determinate specie • possibilità di distinguere speciestrettamente correlate, difficili da distinguere su base fenotipica

9. PCR – D(T)GGE • la migrazione specie-specifica in PCR-DGGE consente l’identificazionediretta (mediante confronto con profili di ceppi di riferimento) o il raggruppamento di isolati sulla basedel profili e della successiva identificazione mediante sequenziamento dell’rDNA • campo d’applicazione: specie LAB e CNC e lieviti isolati da carni fermentate

10. ISR-PCR • studio del polimorfismo delle Intergenic Spacer Region (ISR) 16s e 23s • campo d’applicazione: CNC • impiego in combinazione con altri metodi di identificazione

11. Caratterizzazione di isolati • caratterizzazione di sottospecie • per determinare la biodiversità intra-specifica (spesso al fine di sviluppare starter autoctoni) • studio della performance di colture starter inoculate

12. Caratterizzazione di isolati • Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), plasmid profile, Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) • PCR-based: Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Repetitive Extragenic Palindromic (rep)-PCR

13. RFLP Identified microbial isolate from fermented product Isolate A isolate B isolate C

14. PFGE

15. Plasmid profiling o fingerprinting

16. RAPD - PCR

17. rep - PCR

18. Performance di colture starter

19. Principali risultati dei metodi di caratterizzazione • possibilità di distinguere ceppi con attività tecnologiche rilevanti (es. riduzione nitrati, attività decarbossilasica di amminoacidi, temperatura di crescita)

20. Principali risultati dei metodi di caratterizzazione • parametri ambientali possono influenzare specifici biotipi che hanno la prevalenza al termine della fermentazione – pressione selettiva di una particolare nicchia • popolazioni impianto-specifiche (possono avere origine dalle materie prime e possono essere responsabili delle caratteristiche sensoriali del prodotto finito)

21. Principali risultati dei metodi di caratterizzazione • identificazione di differenti biotipi nell’ambito di una coltura starter e determinazione del biotipo responsabile della fermentazione • Possibilità di distinguere i ceppi aggiunti da quelli naturalmente presenti durante la maturazione del prodotto

22. Metodi coltura-indipendenti per studiare l’ecologia microbica delle carni fermentate

23. Vantaggi degli approcci diretti • manca la fase colturale e quindi l’errore legato all’impiego dei convenzionali terreni colturali per l’enumerazione/isolamento è annullato • rispetto all’approccio classico usato fino ad ora in microbiologia, basato sull’isolamento e l’identificazione di ceppi dalla matrice alimentare, sia con metodi fisiologici/fenotipici, sia con metodi molecolari, gli approcci diretti richiedono meno tempo e meno lavoro • consentono una descrizione simultanea di più popolazioni appartenenti a differenti gruppi microbici

24. L’impiego dell’RNA Il DNA può permanere in un dato ambiente talvolta anche a lungo dopo la morte del microrganismo. Per contro, l’RNA si degrada rapidamente dopo la morte cellulare e, come conseguenza, l’impiego della RT-PCR-DGGE fornisce il fingerprint (o profilo) delle popolazioni vive e metabolicamente attive.

25. DNA RNA Cocolin et al., Applied and Environmental Microbiology, 67, 5113-5121

26. rDNA: la sequenza target più comunemente impiegata • universale • contiene regioni altamente conservate e regioni variabili • disponibile un ampio database di sequenze

27. Impiego della PCR - DGGE Durante il processo di fermentazione – dinamiche di popolazione Sul prodotto finito – biodiversità

28. Lactobacillus curvatus Lactobacillus paracasei Rantsiou et al., Applied and Environmental Microbiology, 71, 1977-1986 Lactobacillus sakei

29. Rantsiou et al., Applied and Environmental Microbiology, 71, 1977-1986

30. Confronto tra prodotti finiti Silvestri et al., Meat science, 77, 413-423

31. Predominanza dei LAB in metodi coltura -indipendenti Cocolin et al. 2009, Meat science, 82, 125-132

32. Lieviti - dinamiche Rantsiou et al., Applied and Environmental Microbiology, 71, 1977-1986

33. Studio dell’ecologia batterica mediante PCR specie-specifica • 12 set di primers per il rilevamento di 6 specie LAB e di 6 specie CNC comunemente presenti nei prodotti carnei fermentati • applicazione a omogenati di insaccati fermentati prima e dopo un arricchimento di 24 ore (in MRS e Mannitol Salt broth) Aymerich et al., Applied and Environmental Microbiology, 69, 4583-4594

34. Quantificazione di Lactobacillus sakei mediante qPCR specie-specifica • quantificazione di L.sakei durante la fermentazione, senza bisogno di fase colturale • applicazione a 11 prodotti commerciali di insaccati e impasti carnei Martin et al., Applied and Environmental Microbiology, 72, 6040-6048

35. Conclusioni • riconoscimento inequivocabile delle specie • possibilità di tracciare un particolare biotipo durante la fermentazione • gli errori legati alla fase colturale vengono superati • possibilità di determinare le popolazioni metabolicamente attive