Az izomdystrophiák molekuláris genetikai vizsgálata

1. Az izomdystrophiák molekuláris genetikai vizsgálata Pikó H., Balog J. Herczegfalvi Á., Mayer P., Mechler F., Horváth R., Karcagi V. Fodor József Országos Közegészségügyi Központ Bethesda Gyermekkórház, DEOE Neurológiai Klinika, Hódmezővásárhelyi Kórház, Jahn-F. Dél-pesti Kórház

2. Izomdystrophiák • Duchenne/Becker izomdystrophia (DMD/BMD) • Facioscapulohumeralis izomdystrophia (FSHD)

3. Általános jellemzők, klinikai tünetek • Előfordulási gyakoriság - DMD 1:3500, BMD 1:30000 • X kromoszómához kötött recesszív öröklődésmenet • A betegség kezdete 2 éves korra tehető, fokozatos progresszióval • Az elhalálozás ideje 20-25 éves korban • A Becker típus esetén enyhébbek a tünetek, nincs korai halál

4. A betegség genetikai háttere, pathomechanizmusa • A dystrophin gén (Xp21) 2.5 Mb méretű, 79 exont tartalmaz és 14 kb méretű mRNS-t kódol • A géntermék a dystrophin fehérje (427 kDa), amely sarcolemmális lokalizációt mutat a dystrophin- asszociált glycoprotein komplex részeként • A DMD esetén a dystrophin teljes hiánya, BMD esetén csökkent mennyisége mutatható ki

5. A betegség kialakulásában szerepet játszó géndefektusok • Deléciók (60%), hot-spot régiók a gén proximalis és distalis részén • Duplikációk (5%) • Pontmutációk (35%) • Minden harmadik esetben új mutáció alakul ki • A mutáció következményei (frame-shift hipotézis) „in-frame” mutáció - BMD fenotípus „out of frame” mutáció - DMD fenotípus

6. Molekuláris diagnosztikai vizsgálatok • Multiplex PCR reakció – 2 x 9 exon vizsgálata egyidejüleg • Southern blot analízis – cDNS próbákkal ( XJ10, 7b8, 30.2, 30.1, 47.4, 60.1) • Immunohistochemia • Western blot technika – fehérje analízis

7. Multiplex PCR deléciós analízis

8. Southern hibridizáció XJ10 cDNS próbával (HindIII és BglII emésztés)

9. Eredmények • Eddig 100 betegnél végeztük el a multiplex PCR analízist, amely alapján a betegek 57%-ában deléciót mutattunk ki • Négy esetben végeztünk prenatális vizsgálatot • A feltételezett hordozó anyák és leánytestvérek (31 fő) cDNS vizsgálata során 18 esetben bizonyítottuk a hordozósági státuszt • Az új módszerek bevezetése a DMD/BMD betegség molekuláris genetikai vizsgálatában lehetőséget biztosít az alábbi célok megvalósításához: deléciók méretének pontos meghatározása de novo mutációs esetek azonosítása hordozósági státusz vizsgálata prenatális vizsgálatok felajánlása

10. Az FSHD molekuláris háttére (1.) • Öröklődésmenete autoszómális domináns, de nem teljes penetranciával (95%-os) • A 4qés10qkromoszómák szubtelomerikus régiójában található D4Z4 ismétlődő szekvenciák • A betegekben a 4q35régióban DNS átrendeződés történik, a D4Z4 szekvenciák száma csökken • Eltérő restrikciós térkép: • - a 4q35 régióban csak egy D4Z4 tartalmaz BlnI hasítási helyet • - a 10q26 régióban minden egyes D4Z4 tartalmaz BlnI hasítási helyet

11. Az FSHD molekuláris háttére (2.) • A p13E-11 polimorf próba detektálja EcoRI emésztés után: • 4q35 38kb-300kb (egészséges), 10kb-38kb (beteg) • 10q26 20kb-320kb • Komplikáló tényező: szubtelomerikus kicserélődések a 4q35 és 10q26 régió között (a populáció 20%-ában) • - PFGE alkalmazása ill. dózis teszt • EcoRI fragmentum mérete korrelál a betegség súlyosságával és a tünetek megjelenésénekidőpontjával • De novo mutációk is→ juvenilis formák

12. Southern analízis értékelése • <38kb BlnI rezisztens fragmentum • FSHD • <38kb BlnI szenzitív fragmentum • dózis teszt • 10-es típusú • repeatek túlsúlyban FSHD • 4-es típusú nem FSHD • repeatek túlsúlyban

13. Dózis analízis Southern hibridizációval

14. FSHD genotípus ikrekben 38 kb 8.5 kb Súlyos, infantilis típus, de novo mutációval, 1 D4Z4 repeat elem maradt 4q35: p13E-11 próbával a betegek EcoRI fragmentuma <38 kb, BlnIrez.

15. FSHD molekuláris vizsgálataink eredményei (2000.-2004.)