FERNANDO DI BENIGNO CORSO DI BIOTECNOLOGIE E BIODIVERSITA’ VEGETALI UNIVERSITA’ DI ANCONA

1. STUDIO COMPARATIVO DELLA CAPACITA’ DISCRIMINANTE DEI MARCATORI RAPD, AFLP E SSR E LA LORO EFFICACIA NELLO STABILIRE LA RELAZIONE GENETICA NELL’OLIVO FERNANDO DI BENIGNO CORSO DI BIOTECNOLOGIE E BIODIVERSITA’ VEGETALI UNIVERSITA’ DI ANCONA FACOLTA’ DI AGRARIA

2. STUDIO COMPARATIVO DELLA CAPACITA’ DISCRIMINANTE DEI MARCATORI RAPD, AFLP E SSR E LA LORO EFFICACIA NELLO STABILIRE LA RELAZIONE GENETICA NELL’OLIVO • Belaj – Z. Satovic – G. Cipriani – L. Baldoni • R. Testolin – L. Rallo – I. Trujillo • 14 Ottobre 2002 • Theor. Appl. Genet. (2003) 107:736 - 744

3. Introduzione L’olivo (Olea europea L.) è una specie subtropicale tipica del bacino del Mediterraneo, dove rappresenta la coltivazione più importante per la produzione di olio destinato all’ uso alimentare. La grande diversità nell’ olivo e la presenza di casi di omonimia e sinonimia accentua il bisogno di trovare metodi efficienti e rapidi in grado di discriminare le varie cv. Un grande aiuto a questo scopo è stato dato dallo sviluppo dei marcatori molecolari i quali hanno creato nuove opportunità nello studio della caratterizzazione e della biodiversità genetica. Una migliore comprensione dell’ efficienza dei marcatori molecolari è considerato un passaggio prioritario nella caratterizzazione del germorplasma dell’ olivo e un prerequisito per migliorare i programmi di miglioramento genetico.

4. Scopo della ricerca • Comparare la capacità discriminante e le informazioni ottenute con i marcatori AFLP, RAPD e SSR per l’identificazione del genotipo e l’analisi della diversità genetica 2. Determinare la similarità genetica stimata e la relazione genetica tra 32 Cv di olivo principalmente coltivate in determinate zone dell’ ITALIA e della SPAGNA 3. Confrontare i pattern di variabilità ottenuti con ogni marcatore

5. Materiali e metodi Tutti i campioni di olivo analizzati sono stati prelevati dal World Olive Germoplasm Bank of the Centro de Investigaciòn y Formaciòn Agraria (CIFA) Alameda del Obispo in Cordoba -Spain-

6. Cultivar analizzate e loro distribuzione geografica SPAGNA

7. Cultivar analizzate e loro distribuzione geografica ITALIA

8. MARCATORI RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) AFLP(Amplified Fragment Lenght Polymorphism) SSR(Single Sequence Repeat)

9. RAPD

10. RAPD Caratteristiche dei marcatori RAPD Sono stati usati 21 primer diversi, provenienti da kits in commercio. Tutte le analisi sono state ripetute 3 volte usando vari lotti di AmpliTaq polimerasi, i prodotti della PCR sono stati separati su gel di poliacrilamide e visualizzati con la tecnica silver staining.

11. AFLP

12. AFLP Caratteristiche dei marcatori AFLP *In alcuni casi si usa la tecnica della fluorescenza o del silver staining Sono stati usati 5 combinazioni di primer con tre nucleotidi selettivi, 4 MseI (M-CAC M-CAA M-CGT M-CTT) e tre EcoRI (E-AGC E-ACT E-AAC)

13. SSR Struttura dei microsatelliti Fra i meccanismi di origine dei microsatelliti c’è anche lo“Slippage replication”

14. SSR Problematica principale

15. SSR • Structure = Repeat (e.g., ga) Unique flanking regions • Number of repeats is highly variable among individuals Design primers ( ) complementary to flanking regions Microsatelliti (Simple Sequence Repeats) Amplify repeat region by polymerase chain reaction

16. SSR Caratteristiche dei marcatori SSR Sono stati utilizzati 8 primers. La cv Frantoio, dalla quale sono stati isolati e sequenziati i microsatelliti, è stata usata come campione di confronto in tutti i gel. Lo scoring e la misurazione degli alleli è stata fatta utilizzando la sequenza del plasmide pUC18 come riferimento nella corsa elettroforetica su gel di poliacrilamide.

17. Riassunto delle caratteristiche dei marcatori

18. RISULTATI LIVELLO DI POLIMORFISMO

19. RISULTATI LIVELLO DI POLIMORFISMO I tre marcatori si sono verificati essere molto efficaci nel discriminare le 32 cultivar di olivo.

20. RISULTATI LIVELLO DI POLIMORFISMO Il numero effettivo di patterns indica la grandezza di un popolazione ideale nella quale, date le frequenze dei pattern ottenuti, tutti gli individui possono essere distinti.Quindi con un primer RAPD si possono distinguere 6 varietà, con una sola combinazione di primer AFLP si possono distinguere 28 varietà mentre con un primer SSR si distinguono circa 8 varietà.

21. RISULTATI COMPARAZIONE DELLE INFORMAZIONI OTTENUTECON I MARCATORI RAPD, AFLP E SSR Tre primer SSR, corrispondenti al 37,5%, generavano bande multiple dovute all’ amplificazione simultanea di differenti loci.Di conseguenza ogni prodotto di amplificazione (Allele) era facilmente identificabile, ma l’ attribuzione degli alleli ai rispettivi locus non era accertabile. Per questo motivo si sono presi in considerazione solo gli altri cinque primers a singolo locus. Questo fenomeno è relativamente comune nelle specie con una origine allopoliploide e potrebbe essere dovuto alla fusione del genoma e alla duplicazione dei cromosomi durante l’ evoluzione

22. RISULTATI ANALISI DEI DENDROGRAMMI • Tutt’e tre i marcatori hanno messo in evidenza un alto grado di similarità nei dendrogrammi, sebbene ci sono state delle differenze nella posizione di alcune cv nei gruppi principali. • Tutti i dendrogrammi riflettono la relazione tra le cv in dipendenza della loro area di coltivazione.

23. RISULTATI • Per l’analisi della similarità è stato applicato il coefficiente di Dice, sia per ogni singolo marcatore che per tutti e tre insieme. • Le cultivars sono state raggruppate attraverso l’analisi cluster usando il metodo UPGMA acronimo di “Unweighted Pair Group Method”

24. UPGMA “Unweighted Pair Group Method” Esempio di costruzione di un alberofilogenetico con il metodo UPGMA

25. UPGMA “Unweighted Pair Group Method” Esempio di costruzione di un alberofilogenetico con il metodo UPGMA

26. UPGMA “Unweighted Pair Group Method” Esempio di costruzione di un alberofilogenetico con il metodo UPGMA

27. UPGMA “Unweighted Pair Group Method” Esempio di costruzione di un alberofilogenetico con il metodo UPGMA

28. UPGMA “Unweighted Pair Group Method” Esempio di costruzione di un alberofilogenetico con il metodo UPGMA

29. RISULTATI SIMILARITA’ E RELAZIONE GENETICA La tabella seguente riassume la similarità genetica calcolata a due a due per tutte le 32 cv di olivo per ogni marcatore. La similarità genetica è espressa come Coefficiente di Dice.

30. DENDROGRAMMA AFLP

31. DENDROGRAMMA AFLP Nel dendrogramma generato dagli AFLP si possono osservare 2 gruppi principali, ai quali si affiancano le cv Bical e Castellana raggruppate separatamente ad una distanza inferiore dello 0.65 1° GRUPPOIn questo gruppo sono presenti 13 cv Spagnole e 5 Italiane.Delle 18 cv Spagnole 8 provengono dal Sud-Ovest e dal Centro, mentre altre 4 cv (Alfafara, Blanqueta, Changlot Real, Castellana) provengono dall’Est.Le 5 cv Italiane sono raggruppate in differenti sottogruppi in accordo alla loro distribuzione geografica.

32. DENDROGRAMMA AFLP Nel dendrogramma generato dagli AFLP si possono osservare 2 gruppi principali, ai quali si affiancano le cv Bical e Castellana raggruppate separatamente ad una distanza inferiore dello 0.65 2° GRUPPO Questo gruppo include 5 cvs Spagnole provenienti dall’ Est insieme a Lechin de Sevilla e Picual entrambi diffuse nel Sud. Insieme alle cvs Spagnole sono presenti in questo gruppo le cvs Coratina, Frantoio, Cellina, Leccino e Leccio del Corno di origine Italiana.

33. DENDROGRAMMA RAPD

34. DENDROGRAMMA RAPD Il dendrogramma ottenuto con i RAPD risulta essere molto simile a quello ottenuto con gli AFLP ma con alcune eccezioni, come ad esempio la cv Blanqueta situata nel gruppo 2 invece che nel gruppo 1 come nel dendrogramma AFLP. Ai livelli dei sottogruppi sono state mantenute alcune associazioni in entrambi i marcatori come, ad esempio, il caso delle cvs Changlot Real, Lechìn de Granada, Verdial de Bedajoz, Moraiolo, Rosciolo e Farga.Inoltre il dendrogramma mette in evidenza un alta similarità tra le cvs provenienti dalla stessa area o nelle vicinanze più di quanto lo faccia gli altri due marcatori.

35. DENDROGRAMMA SSR

36. DENDROGRAMMA SSR Il dendrogramma ottenuto con gli SSR ha evidenziato delle differenze a livello dei sottogruppi. La differenza che più risulta è la discriminazione delle cvs Cellina e Frantoio da parte degli SSR. Cosa che non erano stati in grado di fare gli altri due marcatori. Inoltre le cvs Lechìn de Granada, Moraiolo, e Rosciola hanno formato un gruppo separato insieme alla cv Arbequina seppur mantenendo la stessa relazione genetica fra loro come nei casi degli altri due marcatori.

37. DENDROGRAMMA AFLP+RAPD+SSR

38. DENDROGRAMMA AFLP+RAPD+SSR Il dendrogramma generale è stato costruito mettendo insieme i dati provenienti dai tre marcatori. Esso è risultato molto simile a quelli ottenuti con ogni singolo marcatore. Comunque ci sono alcune differenze che portano ad una migliore rappresentazione della relazione fra le cvs in accordo con la loro area geografica di coltivazione.

39. CONCLUSIONI • Tra le cvs analizzate non è stata riscontrata una differenziazione tra i due paesi (Italia e Spagna), forse dovuta allo scambio reciproco di materiale genetico. • La struttura della diversità genetica comparata con le origini geografiche riflette un processo di selezione multilocale nell’olivo, una limitata diffusione delle cvs all’infuori della loro area di coltivazione e un possibile scambio di materiale vegetale nel corso degli anni.

40. CONCLUSIONI • I tre marcatori hanno discriminato i genotipi molto efficacemente ma solo gli SSR sono riusciti a fare una distinzione fra le cvs Frantoio e Cellina. • Gli SSR hanno evidenziato un alto livello di polimorfismo il quale era atteso in quanto il meccanismo che origina i polimorfismi in questi marcatori (Slippage Replication) è molto frequente. • La natura codominante di questo marcatore permette la scoperta di un alto numero di alleli per locus e di conseguenza ad un alto livello di eterozigosità attesa.

41. CONCLUSIONI Il relativamente alto valore di P (Numero effettivo di pattern/U) per tutti i marcatori usati da un idea di quella che può essere la loro capacità discriminante quando nelle analisi si usano un numero abbastanza alto di campioni. Il risultato di P più alto è stato ottenuto con gli AFLP, probabilmente dovuto all’ alto numero di loci (Bande) amplificati in ogni esperimento. L’alto criterio di conservazione usato per la selezione dei polimorfismi può aver ridotto il valore reale di P ottenuto per i RAPD.

42. CONCLUSIONI COMPARAZIONE DELLE INFORMAZIONI OTTENUTE CON I TRE MARCATORI

43. CONCLUSIONI L’utilità di un marcatore sta nell’equilibrio tra il livello di polimorfismo che può mettere in evidenza e la sua capacità di identificare polimorfismi multipli. (Powell et al. 1996) In quest’ analisi è stato adoperato un indice che riassume la citazione sopra riportata, quest’indice è il Marker Index (MI).Infatti esso è composto da due parti: MI = E x Hep Dove:E= Nu x β = N° di loci polimorfici per unità di saggioHep=Eterozigosità attesa dei loci polimorfici

44. CONCLUSIONI Gli AFLP hanno un MI molto elevato, ma come si vede in tabella è dovuto all’alto valore di E. In altre parole l’elevato valore di MI dipende più dall’alto numero di alleli (Bande polimorfiche) ottenuti in ogni profilo che per l’eterozigosità allelica trovata tra le cvs analizzate.

45. CONCLUSIONI *Per il calcolo degli indici riguardanti i marcatori AFLP sono state prese in considerazione solo 98 bande polimorfiche ben definite. **Tre primer SSR, corrispondenti al 37,5%, generavano bande multiple dovute all’ amplificazione simultanea di differenti loci.Di conseguenza ogni prodotto di amplificazione (Allele) era facilmente identificabile, ma l’ attribuzione degli alleli ai rispettivi locus non era accertabile. Per questo motivo si sono presi in considerazione solo gli altri cinque primers a singolo locus. Questo fenomeno è relativamente comune nelle specie con una origine allopoliploide e potrebbe essere dovuto alla fusione del genoma e alla duplicazione dei cromosomi durante l’ evoluzione

46. CONCLUSIONI • SSR • Basso Marker Index • Alta eterozigosità attesa • Media capacità discriminante • Medio numero di patterns effettivi

47. CONCLUSIONI • AFLP • Alto Marker Index • Alta capacità discriminate • Alto numero di patterns effettivi • Bassa eterozigosità attesa

48. CONCLUSIONI • RAPD • Medio Marker Index • Bassa eterozigosità attesa • Bassa capacità discriminante • Basso numero effettivo di patterns

49. CONCLUSIONI Questi risultati insieme a altre considerazioni di natura pratica ed economica, devono essere prese in considerazione quando si sceglie un marcatore per un applicazione specifica. Nel nostro caso tutte e tre i marcatori si sono dimostrati molto efficienti nel mettere in evidenza la diversità nell’olivo, ma considerando la scarsa riproducibilità degli RAPD e l’alta efficienza degli SSR e degli AFLP limita l’uso dei RAPD in analisi di questo tipo. Comunque rimangono una valida alternativa quando le possibilità economiche sono limitate..

50. CONCLUSIONI SIA I MARCATORI RAPD CHE AFLP SONO MOLTO EFFICIENTI NELLO STABILIRE LA SIMILARITA’ GENETICA NELL’ OLIVO, MENTRE LA NATURA CODIMINANTE DEGLI SSR SARA’ PIU’ INDICATO PER STUDI DI SEGREGAZIONE E MAPPATURA DELL’ OLIVO.