Matryca DNA

1. Skład mieszaniny reakcyjnej PCR • Matryca DNA • Stężenie matrycy DNA zawiera się w przedziale 0.01-1 ng dla DNA plazmidowego lub fagowego i 0.1-1μg dla DNA genomowego w 50μl mieszaniny reakcyjnej • Wyższa ilość matryc DNA (ponad wartości optymalne) najczęściej może powodować wzrost wydajności syntezy niespecyficznych produktów reakcji PCR • jeśli wierność syntezy jest czynnikiem decydującym, to połączenie maksymalnej dopuszczalnej ilości DNA w mieszaninie reakcyjnej z ograniczeniem liczy cykli PCR powinno spowodować % wzrost udziału prawidłowych amplikonów PCR • Prawie wszystkie rutynowo stosowane metody izolacji DNA pozwalają na uzyskanie matryc wysokiej jakości • niewielkie (śladowe) ilości odczynników, które są używane do oczyszczania DNA (fenol, EDTA, proteinaza K, itp.) mocno zahamowują aktywność polimerazy Taq • precypitacja DNA 96% etanolem i powtórne przemywanie precypitatu DNA 70% etanolem jest zwykle wystarczające do usunięcia śladowych zanieczyszczeń z preparatów kwasów nukleinowych.

2. Skład mieszaniny reakcyjnej • Startery • Startery do PCR są zwykle długości 15-30 nukleotydów • Dłuższe startery zapewniają wyższą specyficzność uzyskiwanego produktu • Zawartość par GC powinna wynosić od 40 do 60% • Nukleotydy C i G powinny być rozmieszczone równomiernie w całej sekwencji startera • Więcej niż 3 nukleotydy G lub C na końcu 3’ startera mogą sprawić niespecyficzne wiązanie startera • starter nie powinien być komplementarny względem siebie lub komplementarny do żadnego innego startera w mieszaninie reakcyjnej, w celu uniknięcia tworzenia dimerów lub struktur wyższego rzędu • temperatura topnienia starterów flankujących nie powinna różnić się więcej niż 5ºC, dlatego też zawartość par GC i długość muszą być wybrane odpowiednio • powinny być uwzględnione wszystkie możliwe miejsca komplementarności pomiędzy starterami i matrycą DNA

3. Szacowanie temperatury topnienia startera, jeśli starter jest krótszy niż 25 nukleotydów, przybliżona temperatura topnienia (Tm) jest obliczana przy użyciu następującej formuły: Tm= 4 (G + C) + 2 (A + T) G, C, A, T – ilość poszczególnych nukleotydów w starterze Tm 22-nukleotydowego startera o 59% udziale par GC, obliczona według tej formuły wynosi (13 – G+C, 9 – A+T) Tm= 4 (6 + 7) + 2 (4 + 5) = 4(13) + 2(9) = 70ºC Dla porównania oszacowana temperatura topnienia 22-nukleotydowego startera o 60% udziale par GC w 50 mM KCl według innej formuły wynosi: Tm = 81.5 + 16.65 (log10 [Na+]) + 0.415 (%G+C) – 675 / n [Na+] - stężenie molowe, [K+]=[Na+], n = liczba par zasad w starterze. Tm = 81.5 + 16.65 (log10 0.05) + 0.415 (60) – 675/22 = 81.5 + 16.65 (-1.30) + 24.60 – 30.68 = 53.84°C

4. Temperatura przyłączania startera powinna być obniżona o około 5ºC niż temperatura topnienia (inne podejście zakłada, że powinna być wyższa o 3ºC od tej temperatury) • Jeśli starter jest dłuższy niż 25 nukleotydów, Tm powinna być wyznaczana poprzez zastosowanie wyspecjalizowanych programów komputerowych, które uwzględnią wzajemne oddziaływanie sąsiadujących zasad, wpływ koncentracji soli itp.

5. Stężenie MgCl2 • jony Mg2+ tworzą kompleksy z nukleotydami, starterami i matrycą DNA • optymalne stężenie MgCl2 powinno być dobierane do każdego eksperymentu oddzielnie • Zbyt mało jonów Mg2+powoduje słabą wydajność produktów PCR, nadmiar Mg2+ powoduje pojawianie się niespecyficznych produktów PCR oraz błędy w samym produkcie • Niższe stężenia Mg2+ wskazane są wtedy, gdy dokładność syntezy DNA jest czynnikiem decydującym • Rekomendowana rozpiętość stężeń MgCl2 wynosi 1-4 mM • Przy stężeniu końcowym nukleotydów wynoszącym 0.2 mM, stężenie MgCl2 zawiera się pomiędzy 1.5±0.25mM (tradycyjny bufor PCR z KCl), i 2.0±0.5mM (bufor PCR z (NH4)2SO4). Bufor z (NH4)2SO4 jest odpowiedni do większości zastosowań • Jeśli próbki DNA zawierają np. EDTA stężenie MgCl2 w mieszaninie reakcyjnej powinno być zwiększone

6. Mieszanina nukleotydów (dNTP) • Stężenie każdego z nukleotydów w mieszaninie reakcyjnej wynosi zwykle 100-200µM (0.1-0.2 mM) • Jest bardzo ważne, aby stężenia poszczególnych nukleotydów (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) były identyczne • niedokładności w stężeniach nawet jednego nukleotydu dramatycznie zwiększają poziom błędów w produktach PCR • Jeśli chcemy osiągnąć maksymalną dokładność procesu PCR stężenie dNTP powinno wynosić 10-50µM, ponieważ wierność amplifikacji jest najwyższa właśnie w tym zakresie stężeń • Polimeraza Taq • Zazwyczaj stosujemy 1-1,5 jednostki polimerazy w 50μl mieszaniny reakcyjnej • Wyższe stężenia polimerazy mogą powodować syntezę produktów niespecyficznych • W sytuacji, gdy w mieszaninie reakcyjnej występują różnego rodzaju inhibitory (np. jeśli używana matryca DNA nie jest dokładnie oczyszczona), zalecane są wyższe stężenia polimerazy (2-3 jednostki/50μl).

7. Profil termiczny • Parametry amplifikacji zależą głównie od: • matrycy • sekwencji starterowych • termocyklera • Cykl denaturacji wstępnej • Kompletna denaturacja matrycy DNA na początku reakcji PCR ma kluczowe znaczenie • Niekompletna denaturacja DNA wpływa na mało wydajne wykorzystanie matrycy w pierwszym cyklu amplifikacji i słabą wydajność produktu PCR • Denaturacja wstępna powinna być wykonana przez okres 1-3 min w temperaturze 95ºC, jeśli udział par GC w matrycy jest mniejszy lub równy 50% • Okres ten powinien być wydłużony do 10 minut dla matryc bogatych w pary GC (>50%) • Jeśli denaturacja wstępna jest nie dłuższa niż 3 minuty w 95ºC polimeraza Taq może być dodana do mieszaniny reakcyjnej przed cyklem denaturacji • Jeśli konieczne jest zastosowanie dłuższego czasu denaturacji albo wyższej temperatury, polimeraza powinna być dodana tylko po okresie, albowiem stabilność enzymu dramatycznie obniża się w temperaturach ponad 95ºC.

8. Profil termiczny • Cykl denaturacji właściwej • denaturacja przez okres 0.5-2 minut w temperaturze 94-95°C zazwyczaj jest wystarczająca, albowiem syntetyzowany w pierwszym cyklu produkt PCR jest znacząco krótszy niż matryca DNA i jest kompletnie denaturowany w tych warunkach. • Jeśli amplifikowany fragment DNA charakteryzuje się bardzo dużym udziałem par GC, czas denaturacji może być wydłużony do 3-4 minut • Alternatywnie, można dodać do mieszaniny PCR substancje ułatwiające denaturację DNA np. glicerol (do 10-15% objętości), DMSO (do 10%) lub formamid (do 5%) • W obecności tych dodatków, temperatura przyłączania starterów powinna być ustalana eksperymentalnie, ponieważ temperatura topnienia dupleksu starter-matryca DNA obniża się istotnie • Jeśli stosujemy wymienione powyżej dodatki ułatwiające denaturację, ilość polimerazy Taq w mieszaninie reakcyjnej powinna być zwiększona, ponieważ DMSO i formamid, w proponowanych stężeniach, obniżają aktywność enzymu około 50%.

9. Profil termiczny • Cykl przyłączania starterów • Zazwyczaj optymalna temperatura przyłączania starterów jest o 5ºC niższa od temperatury topnienia dupleksu starter-matryca DNA • Czas inkubacji starterów wynosi zwykle od 30 sekund do 2 minut • Jeśli występują niespecyficzne produkty reakcji PCR (oprócz właściwych, specyficznych), temperatura przyłączania starterów powinna być zoptymalizowana poprzez podwyższanie jej o 1-2ºC. • Cykl wydłużania (syntezy) produktów PCR • Zwykle cykl wydłużania wykonywany jest w temperaturze 70-75ºC • Szybkość syntezy DNA przez polimerazę Taq jest najwyższe właśnie w tej temperaturze (2-4 tys. par zasad/minutę) • 1 minutowy czas wydłużania jest wystarczający do syntezy fragmentów PCR do około 2 tys. par zasad. Kiedy amplifikujemy dłuższe fragmenty DNA (amplikony), czas syntezy jest zwykle wydłużany do 1 minuty na każde 1000 pz amplifikowanego fragmentu DNA.

10. Profil termiczny • Cykl wydłużania końcowego • Po ostatnim cyklu, próbki przechodzą zwykle okres inkubacji w temperaturze 72ºC przez 5-15 minut, aby wypełnić końce nowo syntetyzowanych produktów PCR • Dodatkowo, w czasie tego cyklu, aktywność transferazy polimerazy Taq pozwala na dodanie nukleotydów A na końcach 3’ produktów PCR • Dlatego, jeśli fragmenty PCR są klonowane do wektorów T/A, cykl ten może być wydłużony nawet do 30 minut. • Liczba cykli • Liczba cykli PCR zależy od zawartości (ilości) matryc DNA w mieszaninie reakcyjnej, i od oczekiwanej wydajności produktu PCR • Dla mniej niż 10 kopii matrycowego DNA, powinno się wykonać 40 cykli • Jeśli początkowa ilość matryc DNA jest wyższa, 25-35 cykli zwykle wystarcza.

11. IZOLACJA DNA Z ŻELU AGAROZOWEGO • Procedura klonowania genów wymaga umiejętności oczyszczania cząsteczek DNA o ściśle określonej wielkości • W tym celu przeprowadza się elektroforezę w żelu agarozowym, wycina prążek o odpowiedniej mobilności i następnie oczyszcza DNA od agarozy • Żel agarozowy zawiera substancje mogące negatywnie wpływać na reakcje enzymatyczne z udziałem DNA, dlatego skuteczność oczyszczenia ma kluczowe znaczenie dla powodzenia przeprowadzanych później manipulacji • Szczególnie wrażliwe na zanieczyszczenia są ligacja i sekwencjonowanie DNA • Istnieje wiele sposobów izolacji DNA z żelu agarozowego, najskuteczniejsze wydają się zestawy oferowane przez dostawców materiałów laboratoryjnych. Działają one najczęściej według następującego schematu: • rozpuszczenie żelu • adsorpcja DNA • przemywanie DNA • elucja DNA