Dr. Juan Pablo Damián Área de Bioquímica Facultad de Veterinaria, Montevideo, Uruguay . UdelaR

1. Descarboxilaciónoxidativa del piruvato Dr. Juan Pablo Damián Área de Bioquímica Facultad de Veterinaria, Montevideo, Uruguay. UdelaR

2. Objetivo: comprender la descarboxilación oxidativa del piruvato y su regulación 1) Introducción - Producción de acetato. - Ubicación en la célula. Condiciones energéticas. - Complejo multienzimático de la Piruvato deshidrogenasa. 2)Pasos 3) Balance global 4) Regulación 5) Resumen

3. Introducción

4. Si se necesita Energía (ATP), y se dispone de Oxígeno qué eventos metabólicos ocurren en la célula ? Respiración Celular Se consume O2 y se produce CO2 a nivel celular.

5. Panorámica del metabolismo Fases o Etapas de la respiración celular

6. Fases o Etapas de la respiración celular 6 C Moléculas de combustible orgánico se oxidan para dar Acetil-CoA. 3 C 1 C 2 átomos de carbono SCoA CH3 C Se incorporan grupos acetilos al ciclo de Krebs, con Liberación de CO2 y coenzimas reducidas. O Los coenzimas reducidos se oxidan en la Cte- con el Consumo de O como último aceptor de e- y la producción de ATP por fosforilación oxidativa.

7. Fases o Etapas de la respiración celular Moléculas de combustible orgánico se oxidan para dar Acetil-CoA. 2 átomos de carbono SCoA CH3 C Se incorporan grupos acetilos al ciclo de Krebs, con liberación de CO2 y coenzimas reducidas. O 1 C 2 átomos de carbono como CO2 1 C Los coenzimas reducidos se oxidan en la Cte- con el Consumo de O como último aceptor de e- y la producción de ATP por fosforilación oxidativa.

8. Fases o Etapas de la respiración celular Moléculas de combustible orgánico se oxidan para dar Acetil-CoA. Se incorporan grupos acetilos al ciclo de Krebs, con liberación de CO2 y coenzimas reducidas. Los coenzimas reducidos se oxidan en la Cte-, liberando protones y electrones. Los e- son transferidos por varios trasnportadores hasta llegar al O como último aceptor de e- , y se produce ATP por fosforilación oxidativa.

9. Fases o Etapas de la respiración Aas tb´dan Piruvato? Mitocondria

10. Sin Oxígeno, el piruvato no entra en la mitocondria Oxidándose de forma incompleta a lactato. ATP ATP Aas tb´dan Piruvato? Lactato

11. Fases o Etapas de la respiración En presencia de Oxígeno…. Aas tb´dan Piruvato? ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP ATP

12. Fases o Etapas de la respiración Descarboxilación oxidativa Aas tb´dan Piruvato?

13. Producción de acetato, organismos aeróbicos Los carbohidratos, lípidos y aminoácidos son oxidados a CO2 y H2O en el ciclo de Krebs y en la cadena respiratoria. La entrada de casi todos los “combustible” al Ciclo de Krebs es como Acetil-coenzima A (Acetil-SCoA o Acetil-CoA) El piruvato (proveniente de la glucólisis y del metabolismo de aminoácidos) se oxida para dar Acetil-CoA y CO2.

14. Ubicación celular del piruvato y condiciones energéticas La oxidación del piruvato a Acetil-CoA en las células eucarióticas se realiza en las mitocondrias y en las procarióticas en el citosol. El piruvato se produce en el citosol ¿como pasa a la mitocondria?

15. Fases o Etapas de la respiración Piruvato H+ Aas tb´dan Piruvato? Piruvato H+ transportador especifico (piruvato - H+Simport).

16. La descarboxilaciónoxidativa del piruvato se “activa” cuando el nivel energético en la célula “es bajo” Si el nivel energético “es bajo” ¿como es la concentración de ATP en relación a la de ADP y Pi? La concentración de ATP es menorque la de ADP, AMP y Pi Normalmente en la célula [ATP] 5-10 mM [AMP] < 0,1 mM

17. Cambios relativos en [ATP] y [AMP] cuando se consume

18. Reacción global de la descarboxilación oxidativa del priuvato CoA-SH NAD+ NADH CO2 -O O C CH3 C S-CoA 1 C O O 2 Complejo piruvato deshidrogenasa (E1 + E2 + E3) CH3 3 Acetil-Co-A Piruvato Reacción IRREVERSIBLE ∆G’o = -33.4 kJ/mol Complejo multienzimático no puede unir de nuevo el CO2 al Acetil-CoA, reacción irreversible en condiciones fisiológicas en condiciones fisiológicas es una reacción irreversible (el complejo no puede unir de nuevo CO2), donde el piruvato pierde un grupo carboxilo como C02, al tiempo que los dos carbonos restantes se transforman en el grupo acetilo del acetil-CoA.

19. Reacción global de la descarboxilación oxidativa del priuvato CoA-SH NAD+ NADH CO2 -O O C CH3 C S-CoA 1 C O O 2 Complejo piruvato deshidrogenasa CH3 3 Acetil-Co-A E1 + E2 + E3 Piruvato Complejo de la piruvato deshidrogenasa (riñón bovino) micrografia crioelectrónica En mamíferos diámetro aprox 50 nm (5 veces tamaño ribosoma, visible al microscopio)

20. Reacción global de la descarboxilación oxidativa del priuvato CoA-SH NAD+ NADH CO2 -O O C CH3 C S-CoA 1 C O O 2 Complejo piruvato deshidrogenasa CH3 3 Acetil-Co-A E1 + E2 + E3 Piruvato

21. Reacción global de la descarboxilación oxidativa del priuvato CoA-SH NAD+ NADH CO2 -O O C CH3 C S-CoA 1 C O O 2 Complejo piruvato deshidrogenasa CH3 3 Acetil-Co-A E1 + E2 + E3 Piruvato Formado por copias múltiples de tres enzimas: E.coli E.coli Enzima E1 : piruvato deshidrogenasa E2 : dihidrolipoil transacetilasa E3 : dihidrolipoil deshidrogenasa N°/complejo 24 24 Bov(60) 12 N°/complejo 24 24 Bov(60) 12 E1 contiene TPP Varía según la especie E3 contiene FAD Dos proteínas reguladoras: Quinasa y Fosfoproteína Fosfatasa

22. Organización estructural del complejo multienzimático de la piruvato deshidrogena (E. coli) Diferencias en número de copias de cada E entre organismos Todas combinadas (60 Sub-U) E2 (24 Sub-U) E1 (24 Sub-U) E3 (12 Sub-U) E2: dihidrolipoil transacetilasa E1 : piruvato deshidrogenasa E3 : dihidrolipoil deshidrogenasa

23. Levadura E2 Núcleo interno (sitio activo) Lipoilo

24. ¿Que ventajas mecanicistas tiene una reacción catalizada por un complejo multienzimático? Los intermediarios químicos que se forman permanecen unidos a la superficie de las enzimas mientras se transforma el sustrato en el producto. Lo que permite que los intermedios puedan reaccionar rápidamente sin que difundan fuera de la superficie del complejo 1) Minimiza la distancia entre el sustrato y el sitio activo de la enzima, aumentando la frecuencia de “choques”. 2) Canaliza los intermediarios metabólicos entre las sucesivas enzimas. 3) Puede ser controlada coordinadamente. Los complejos multienzimáticos son un “avance” en la evolución de la catálisis enzimática.

25. Reacción global de la descarboxilación oxidativa del priuvato CoA-SH NAD+ NADH CO2 -O O C CH3 C S-CoA 1 C O O 2 Complejo piruvato deshidrogenasa CH3 3 Acetil-Co-A E1 + E2 + E3 Piruvato ∆G’o = -33.4 kJ/mol Utiliza 5 coenzimas diferentes: 5 cofactores: (ión inorg. o co-E necesario para actividad de E) 1) Flavinaadeninadinucleótido (FAD) unido a E3 2) Nicotinamidaadeninadinucleótido (NAD), sustrato de E3 3) Pirofosfato de tiamina (TPP), (Tiamina=Vit B1) unido a E1 4) Lipoamida (ácido lipoico) o Lipoato unido a E2 5) Co-enzima A (Co-A), sustrato de la E2

26. Reacción global de la descarboxilación oxidativa del priuvato CoA-SH NAD+ NADH CO2 -O O C CH3 C S-CoA 1 C O O 2 Complejo piruvato deshidrogenasa CH3 3 Acetil-Co-A E1 + E2 + E3 Piruvato FAD ∆G’o = -33.4 kJ/mol Utiliza 5 coenzimas diferentes: 5 cofactores: (ión inorg. o co-E necesario para actividad de E) 1) Flavinaadeninadinucleótido (FAD) unido a E3 2) Nicotinamidaadeninadinucleótido (NAD), sustrato de E3 3) Pirofosfato de tiamina (TPP), (Tiamina=Vit B1) unido a E1 4) Lipoamida (ácido lipoico) o Lipoato unido a E2 5) Co-enzima A (Co-A), sustrato de la E2

27. oxidado oxidado (Vitamina B2) (sustrato de E3) Porción de adenosina en rosado (unido a E3)

28. Complejo piruvato deshidrogenasa

29. Reacción global de la descarboxilación oxidativa del priuvato CoA-SH NAD+ NADH CO2 -O O C CH3 C S-CoA 1 C O O 2 Complejo piruvato deshidrogenasa CH3 3 Acetil-Co-A E1 + E2 + E3 Piruvato (TPP, LIPOATO, FAD) ∆G’o = -33.4 kJ/mol Utiliza 5 coenzimas diferentes:

30. Complejo piruvato deshidrogenasa

31. Reacción global de la descarboxilación oxidativa del priuvato CoA-SH NAD+ NADH CO2 -O O C CH3 C S-CoA 1 C O O 2 Complejo piruvato deshidrogenasa CH3 3 Acetil-Co-A E1 + E2 + E3 Piruvato (TPP, LIPOATO, FAD) ∆G’o = -33.4 kJ/mol Utiliza 5 coenzimas diferentes:

32. Grupo lipoilo oxidado Transorte de grupo acilo Transporte de e- Azul=dominio lipoilo E2 E2

33. Complejo piruvato deshidrogenasa Forma oxidada Forma acetilada Forma reducida

34. Reacción global de la descarboxilación oxidativa del priuvato CoA-SH NAD+ NADH CO2 -O O C CH3 C S-CoA 1 C O O 2 Complejo piruvato deshidrogenasa CH3 3 Acetil-Co-A E1 + E2 + E3 Piruvato (TPP, LIPOATO, FAD) ∆G’o = -33.4 kJ/mol Utiliza 5 coenzimas diferentes: Grupo tiol reactivo, Importnacia para transferencia de Grupos acilos o acetilos. (unión covalente: tioésteres)

35. Coenzima A (CoA) ADENINA ADP Enlace tioéster Enlace amida (vitamina) Grupo acetilo (unido como tioéster) (sustrato de E2) Coenzima Atransportadora de gruposacilo o acetilo

36. Descarboxilación oxidativa Aas tb´dan Piruvato? • AcetilCoA: • Producto de la degradación de CH, Lipidos y aas • compuesto de “alta energía”, ∆G’o = -31.5 kJ/mol • (hidrólisis del enlace tioester, más exergónica que • la del ATP que es -30.5 KJ/mol). • Es el principal combustible del ciclo de Krebs: • es la forma en que el ciclo del ácido cítrico acepta • la mayor parte del combustible aportado

37. Descarboxilación oxidativa del piruvato: requiere de 5 enzimas (E1, E2, E3, y dos reguladoras), 5 cofactores y se realiza en 5 pasos o reacciones.

38. Los 5 pasos

39. Los productos intermedios permanecen unidos al complejo piruvato deshidrogenasa

40. Los productos intermedios permanecen unidos al complejo piruvato deshidrogenasa C2 C1 El C-2 pasa de un estado de oxidación (piruvato) a un aldehído, se une al TTP En forma de grupo hidroxietilo 1: descarboxilación del piruvato a hidroxietil- TPP. E1: piruvato deshidrogenasa

41. Los productos intermedios permanecen unidos al complejo piruvato deshidrogenasa El grupo hidroxietilo se oxida para formar un ácido carboxílico (acetato) (2 electrones que se liberan reducen la unión disulfuro de lipoamida) 2: oxidación del hidroxietil a acetil y se activa la E1. E1: piruvato deshidrogenasa

42. Los productos intermedios permanecen unidos al complejo piruvato deshidrogenasa Forma reducida lipoilo 3: transesterificación con CoA. La energía de oxidación impulsa la formación de un tioéster del acetato, el acetil CoA. E2: dihidrolipoil transacetilasa

43. Los productos intermedios permanecen unidos al complejo piruvato deshidrogenasa Forma reducida lipoilo 4 y 5: transferencias electrónicas para la regeneración de la forma oxidada (disulfuro) del grupo lipoilo de E2

44. Los productos intermedios permanecen unidos al complejo piruvato deshidrogenasa 4: oxidación del grupo SH (tiol) de E2 para dar S-S (disulfuro, oxidada) E3: dihidrolipoil deshidrogenasa

45. Los productos intermedios permanecen unidos al complejo piruvato deshidrogenasa 5: oxidación del FADH2 de E3 a expensas del NAD+ para dar NADH (reducido). E3: dihidrolipoil deshidrogenasa Complejo preparado para iniciar un nuevo ciclo catalítico

46. Reacción global CoA-SHNAD+ NADH CO2 O OCH3-C-C O- O CH3-C-S-CoA Complejo piruvato deshidrogenasa Acetil-Co-A Piruvato Piruvato + CoA(SH) + NAD+ AcetilCoA + CO2 + NADH + H+

47. Regulación del complejo multienzimático de la piruvato deshidrogenasa

48. a) Inhibición por producto NADH + H+ - - Acetil-CoA

49. Regulación alostérica Inhibición por producto Acetil-CoA CoA NADH + H+ NAD+ + - ATP AMP AGs cadena Larga Ca2+

50. Regulación del complejo multienzimático de la piruvato deshidrogenasa b) Control por modificación covalente de E1 Activadores de quinasa Acetil-CoA NADH, ATP Regulador alostérico de la fosfatasa Reguladores alostéricos de la quinasa ATP Acetil-CoA NADH + H+ E1-OH (hidroxilada) Activa Inactiva Inactivan E1 Quinasa Fosfatasa Ca2+ ATP Piruvato ADP Ca2+ Inhibidores de quinasa piruvato ADP Ca2+ (altos) E1-OPO32-(fosforilada) Inactiva ADP Activador de fosfatasa Ca2+(alto) activa