Abbildung 1 Beispiele von mit pan-anti-CK immunzytochemisch gefärbten DTZ

1. Nachweis von disseminiertern Tumorzellen im Blut von Patienten mit Harnblasenkarzinom U. Schmidt1, U. Bilkenroth2 , K. Robel1, C. Linné1, U. Heberling1, S. Füssel1, O.W. Hakenberg1, A. Meye1, M.P. Wirth1 1Klinik und Poliklinik für Urologie, Technische Universität Dresden, 2Institut für Pathologie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Zusammenfassung Ziel: Isolation von disseminierten Tumorzellen (DTZ) aus dem Blut von Patienten mit Harnblasenkarzinom, um Behandlungsmodalitäten im Hinblick auf ihre Wirkung bezüglich einer Tumorzellaussaat zu vergleichen Material und Methoden: Von 101 Patienten mit Harnblasenkarzinom, die sich in unserer Klinik einer transurethralen Resektion (TUR), einer Zystektomie (CE) oder einer Chemotherapie (CT) unterzogen, wurden insgesamt 224 Proben von je 16ml peripherem Blut gesammelt (1-10 Proben pro Patient). Es wurden sowohl vor als auch nach einer entsprechenden Behandlung Proben asserviert. Die Zellen wurden zunächst über einen Ficoll-Gradienten aufgetrennt. Danach wurde die mononukleäre Zellfraktion isoliert, gewaschen und mit anti-CD45-Microbeads markiert. Nach Auftrennung dieser Mischung mit Hilfe eines autoMACS-Gerätes wurde die CD45-negative Fraktion auf einem Zytospin-Objektträger aufgefangen. Dieser wurde zentrifugiert, der Überstand verworfen und einer Immunzytochemie mit einem pan-anti-Cytokeratin(CK)-Antikörper unterzogen. Die Gegenfärbung erfolgte mit Hämalaun. Ein erfahrener Pathologe begutachtete die Objektträger. Zusätzlich wurden chromosomale Veränderungen mit Hilfe eines kommerziellen Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungssondensets (FISH) nachgewiesen. Ergebnisse: 23/69 (33%) der vor einer TUR gesammelten Proben und 6/17 (35%) der vor einer Zystektomie gesammelten Proben enthielten DTZ, die durch ihre Cytokeratinfärbung und/oder ihre abnorme Zellmorphologie gekennzeichnet waren. Alle mit FISH charakterisierten Proben enthielten chromosomale Aberrationen. Nach TUR bzw. Zystektomie betrug der Anteil der Proben mit DTZ noch 11/45 (24%) bzw. 4/19 (21%). In der CT-Gruppe betrug der Anteil der positiven Proben 14/58 (24%) bei 10/21 (48%) der Patienten. Schlussfolgerung: DTZ sind bei Patienten mit Harnblasenkarzinom in jeder Stufe der Krankheit nachweisbar, aber häufiger vor als nach einer therapeutisch-chirurgischen Intervention. Ergebnisse I 64/208 (31%) Proben enthielten DTZ, nach den Ergebnissen der Immunzytochemie und/oder aufgrund einer abnormen zellulären Morphologie beurteilt mittels Immunozytochemie (Abb. 1). Da mehr als 75% der Zellen mit abnormer Morphologie keine deutliche CK-Proteinexpression aufwiesen (Abb. 1b), sollte das Wesen dieser Zellen mit einer speziell zum Nachweis von Harnblasentumoren entwickelten FISH-Methode aufgezeigt werden. Daher wurde ein kommerziell erhältliches Sondenset (UroVysion-Kit) auf eine Serie von 5 Objektträgern mit Zellen anormaler Morphologie ohne CK-Färbung hybridisiert. Representative Beispiele dieser FISH-Experimente sind in Abbildung 2 dargestellt. Alle 5 Proben wiesen ein aberrantes FISH-Muster auf. 34/104 (33%) Proben von Patienten, die sich einer TUR der Blase unterzogen, enthielten DTZ. Teilt man die Proben in prä- und postoperativ gewonnene, so sank der Probenanteil mit DTZ nach TUR (33% vs. 24%). 11/39 (28%) Proben von Patienten, die sich einer radikalen Zystektomie unterzogen, enthielten DTZ. Teilt man die Proben in prä- und postoperativ gewonnene, so sank der Probenanteil mit DTZ nach Zystektomie, d.h. 6/17 (35%) Proben enthielten DTZ vor Zystektomie wohingegen nur 4/19 (21%) DTZ danach enthielten. Der Anteil positiver Proben in der CT-Gruppe war 14/58 (24%). • Abbildung 2 Beispiele von mit Hilfe des UroVysion-Kits (FISH) untersuchten DTZ a-e) Patient 24 (pT1 pN0 M0 G2, nach TUR) f-j) Patient 374 (pT4 pN1 M0 G3, Chemotherapie) a, f) Chromosom-3-Signale in Rot und Chromosom-7-Signale in Grün b, g) 9p21-Signale in Gold c, h) Chromosom-17-Signale in Aquablau d, i) DAPI-Kernfärbung e, j) Stapel aller Einzelbilder Weiße Kreise markieren Zellen mit einem aberranten Chromosomenmuster. 2 oder mehr verschiedene Farben mit mehr als 2 Signalen deuten auf eine Zelle malignen Ursprungs hin. Normale Zellen mit einem normalen Chromosomenmuster befinden sich außerhalb der weißen Kreise. Vergrößerung 400x • Abbildung 1 Beispiele von mit pan-anti-CK immunzytochemisch gefärbten DTZ a)Zelle von Patient 469 (pT2a pNx M1 G3, Chemotherapie) mit CK-Färbung b) Zelle von Patient 428 (pT3 pN0 M0 G3, vor TUR) ohne CK-Färbung, aber mit anormaler Morphologie Vergrößerung 400x a b c d e a b f g h i j • Methode • peripheres Blut (16mL EDTA-Blut) • Ficoll-Gradientenzentrifugation (650g, 20min) • Waschen und Zentrifugation der MNZ • Leukozytenmarkierung (40µl CD45-Microbeads; 15min, 4°C) • autoMACS (Miltenyi Biotec), “deplete sensitive”-Modus • Zytospinzentrifugation der CD45- Zellpopulation (1 Objektträger) • Immunzytochemie (ICC: anti-CK-AK MNF116, Dako) • Pathomorphologische Begutachtung:Nachweis & Quantifizierung von disseminierten Tumorzellen • Analyse aberranter Chromosomenmuster in ausgewählten Proben mittels Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) mit Hilfe des UroVysion-Kits (Abbott) • Vergleich mit klinischen Daten der betroffenen Patienten • Abbildung 3 Linke Spalte: Verteilung der DTZ-enthaltenden Proben nach TNM-Stadium und Grading. Die Anzahl der positiven Proben ist am Fuß der Säulen notiert, die Gesamtprobenzahl pro Gruppe steht darunter. Rechte Spalte: Mediane Anzahl an DTZ pro positiver Probe entsprechend TNM-Stadium und Grading. TURpre - vor TUR gewonnene Proben, TURpost - nach TUR gewonnene Proben, CEpre - vor Zystektomie gewonnene Proben, CEpost - nach Zystektomie gewonnene Proben, CT - vor einem neuen Chemotherapie-Zyklus gewonnene Proben Ergebnisse II In gepaarten Proben, d.h. eine vor und eine nach einer chirurgischen Intervention gewonnenen Probe ein- und desselben Patienten, wurden positive Befunde in beiden Proben bei 5/33 (15%) in der TUR-Gruppe und 1/8 (13%) in der Zystektomie-Gruppe erhoben. DTZ wurden in 8/33 (24%, TUR) und 2/8 Fällen (25%, Zystektomie) vor, jedoch nicht mehr nach der Intervention nachgewiesen. Zwei Patienten hatten nach der TUR positive Proben, obwohl vorher in ihrem Blut keine DTZ nachgewiesen werden konnten. 18/33 (55%) und 5/8 (62%) gepaarte Proben waren sowohl vor als auch nach TUR bzw. Zystektomie negativ für DTZ. Das Follow-up aller dieser Patienten wurde erhoben. In der Zystektomie-Gruppe waren keine Fälle eines Rezidivs oder eines Fortschreitens nach einer medianen Nachbeobachtungszeit von 8 Monaten (1-43 Monate) zu beobachten. In der TUR-Gruppe waren 7/18 (39%, negativ/negativ), 2/8 (25%, positiv/negativ), 4/5 (80%, positiv/positiv) und 1/2 (50%, negativ/positiv) Rezidive nach einer medianen Nachbeobachtungszeit von 9 Monaten zu beobachten (0-38 Monate). Das bedeutet, dass 71% (5/7) der Patienten mit DTZ im Blut nach TUR einen Progress hatten im Vergleich zu 35% (9/26) ohne DTZ-Nachweis. MNZ Bis zu 20 Blutproben pro Tag Immunmagnetische Zellsortierung (MACS) CD45+ CD45- markierte MNZin 1 mL PBS