IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS de interés médico

1. IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS de interés médico TRABAJO PRÁCTICO N° 8 Natalia Peralta – Bioquímica Parasitología y Micología UNSL

2. Levaduras más frecuentemente asociadas a las infecciones sistémicas: • Candida albicans • Candida parapsilosis • Candida tropicalis • Candida glabrata • Candida krusei • Candida guilliermondii • Cryptococcus neoformans • Trichosporon spp.

3. Colonia cremosa de color blanco amarillento, lustrosa, poco elevada y de bordes bien definidos. • Cuando se observa el desarrollo de una colonia sobre cualquiera de los tubos del primocultivo, se procede a identificar el aislamiento. • El primer paso en el estudio de una levadura es la obtención de un cultivo puro a partir del cual se puedan iniciar los estudios sistemáticos de sus características morfológicas, fisiológicas y sexuales bajo condiciones estandarizadas.

4. La identificación puede variar desde unos pocos test simples, para identificación presuntiva de Cándida albicans y Cryptococcusneoformans a una gran variedad de pruebas necesarias para identificar a todas las levaduras comúnmente aisladas en los laboratorios de micología.

5. Pruebas para identificación de levaduras: 1- Prueba de formación de tubo germinativo por Candidaalbicans. 2- Prueba de formación de Clamidosporas por Candidaalbicans. 3- Agar semillas de girasol para diferenciación de Cryptococcusneoformans. 4- Prueba de la producción de ureasa para Cryptococcusneoformans. 5- Crecimiento a 28 º C y 37 º C. 6- Crecimiento en extracto de malta para estudio micromorfológico. 7- Cultivo en lámina en agar morfología (Difco) para estudio micromorfológico. 8- Crecimiento en agar morfología (Difco) para macromorfología. 9 - Ensayo de asimilación de Glucosa, Galactosa, L-Sorbosa, Celobiosa, Trehalosa, Sacarosa, Maltosa, Lactosa, Melibiosa, Rafinosa, Melezitosa, D-Xilosa, L-arabinosa, D-ribosa, D-manitol, ácido cítrico, eritritol y m-Inositol. 10 - Ensayo de asimilación de nitrato de potasio y peptona. 11 - Ensayo de fermentación de Glucosa, Sacarosa, Galactosa, Maltosa, Trehalosa y Lactosa. 12 - Crecimiento en medio libre de vitaminas. 13 - Producción de ascosporas.

6. Reactivos comerciales • Permiten arribar a la identificación presuntiva: - ChromagarCandida - Chromagar ID • Permiten la identificación confirmatoria: - ID 32C - YeastStar - API 20C - Auxacolor - Vitek - RapIDYeast Plus system - Fungichrom

7. Algoritmo de identificación presuntiva

9. PRUEBAS PARA IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA DE LEVADURAS

10. Prueba de formación de tubo germinativo - Prueba más confiable para identificar presuntivamente a Candidaalbicans. - Procedimiento: Realizar suspensión ligera de un cultivo de 24 h de la cepa en estudio en 0,5 ml de suero bovino.

11. Tubo germinativo • El tubo germinal es una extensión filamentosa de la levadura, sin estrechamiento en su origen cuyo ancho suele ser la mitad de la célula progenitora y su longitud tres o cuatro veces mayor que la célula madre.

13. • Existe un 10% de falsos positivos y 10% de falsos negativos. • Influye la experiencia del operador.

14. La estructura A corresponde a un verdadero tubo germinativo La estructura B es un falso positivo

15. Observación de la Micromorfología - Se debe realizar siempre, ya sea para la identificación presuntiva como para la identificación completa. - Se puede realizar en EXTRACTO DE MALTA LÍQUIDO, para observación de las principales estructuras que caracterizan a la reproducción vegetativa.

17. - Se puede realizar en AGAR HARINA DE MAÍZ, que permite la observación de la disposición de las estructuras y además, en el caso de C. albicans, se puede ver la formación de clamidoconidias. C. albicans: Clamidosconidias y disposición de blastoconidias y pseudomicelio.

18. Siembra en un agarcromogénico - Especialmente CHROMagarCandida que permite identificar: • C. albicans (verde) • C. tropicalis (azul) • C. krusei (rosa seca)

20. Prueba de ureasa (Agar urea de Christensen) - C. neoformansy otros Cryptococcusspp. e incluso otras levaduras producen ureasa. C. albicansy otras especies del género Candida no la producen. - El medio de urea que se usa contiene rojo de fenol, que vira al color rojo cuando se hidroliza la urea y se libera amonio alcalinizando el medio de cultivo.

21. Agar semillas de girasol - C. neoformansproduce un pigmento marrón en el agar semillas de girasol a temperatura ambiente debido a la actividad fenoloxidasa localizada en la pared celular de este hongo. Ninguna otra especie de este Género, ni otras levaduras, poseen esta propiedad. - Para identificación de C. neoformans .

22. Prueba de asimilación de trehalosa - Para identificar presuntivamente a Candidaglabrata, debido a que fermenta y asimila la trehalosa. Sin embargo, otras levaduras también fermentan la trehalosa, tal es el caso de Candidatropicalis, por tal motivo deberá basarse en la MICROMORFOLOGÍA para la utilización de esta prueba.

33. En reumen: Algorismo de identificación presuntiva de levaduras

34. PRUEBAS PARA IDENTIFICACIÓN DEFINITIVA DE LEVADURAS

35. Los métodos que existen actualmente en el mercado son los siguientes: • ID 32C • API 20C • VITEK YBC system (bioMérieux-Vitek) • VITEK 2 System • Fungichrom • YeastStar • Auxacolor • RapIDYeast Plus system

36. Método más comúnmente usado. • No pudieron ser identificadas: C.albicans, C.guilliermondii, C.neoformans, Rhodotorulaspp y S.cerevisiae. • Mejor identificación de cepas atípicas. • Tira de plástico con 32 pocillos con diferente sustratos deshidratados. • Lectura a las 48 hs (T° 30°C). • Lectura visualmente . Crecimiento: Turbidez en el pocillo. • Resultados: Biocódigo numérico de 8 dígitos que permite la identificación a través de un manual de códigos.

37. La identificación levaduras se basa en la presencia o ausencia de ciertas enzimas, que se visualiza mediante reacciones colorimétricas. • La actividad enzimática se revela con: 1. Hidrólisis de sustratos cromogénicos. 2. Asimilación de sustratos naturales. 3. Oxidación de sustratos sintéticos (fenoloxidasa). • Tira de plástico con 16 pocillos con los sustratos. • Se prepara un inóculo y se siembran dos gotas en cada una de las celdas. • Se incuba 24 o 48 horas a30ºC . • Lectura: Cambio de color. • Interpretación de resultados: a través de un sistema de códigos y utilización de una tabla.

38. GRACIAS MUCHAS