1 / 10

Block: „Molekulare Zellbiologie von Immunzellen“ SS 2008

Block: „Molekulare Zellbiologie von Immunzellen“ SS 2008. Ergebnispräsentation: „ Klonierung von Cytohesin-Mutanten “. Referent: Marcell Louis. Klonierung von Cytohesin-Mutanten :. Einführung von Punktmutation in Cyh-1. R281K. E157K. V. a. zur Strukturaufklärung von Proteinen.

tannar
Download Presentation

Block: „Molekulare Zellbiologie von Immunzellen“ SS 2008

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Block: „Molekulare Zellbiologie von Immunzellen“ SS 2008 Ergebnispräsentation: „Klonierung von Cytohesin-Mutanten“ Referent: Marcell Louis

  2. Klonierung von Cytohesin-Mutanten: Einführung von Punktmutation in Cyh-1 R281K E157K V. a. zur Strukturaufklärung von Proteinen

  3. PCR-Mutagense: 1. Schritt: E157K 471bp 723bp R281K 843bp 351bp (Splicing by Overlap-Extension) 2. Schritt: 1,194 kb

  4. Gelbilder der PCR-Mutagenese und SOEing-PCR: Marker Mutagenese: Marker SOEing: E157K R281K 843bp 947 831 E157K R281K 564 723bp 1375 351bp 947 471bp 1194bp 1194bp Daraufhin: Reinigung (CHCl3/Phenol) + Fällung

  5. Verdau: Cyh-1 (mutiert) ~ 1,2 kb NotI Kontrolle des Verdaus MluI Marker Verdaukontrollen 4,7 kb Restriktionsenzyme: MluI A/CGCGT NotI GC/GGCCGC Nach Verdau: Dephosphorylierung der 5‘-Enden verringert Religationswahrscheinlichkeit

  6. Verdau-Kontrolle des Plamids: Unverdauter Vektor Marker 4,7 kb 4,2-4,9kb Vektor (verdaut) Verdau-Kontrollen der Vektoren Low-Melting-Gel erleichtert Isolierung der DNA Isolierung durch Exzision unter UV-Licht

  7. Ligation/Transformation/‘Minipräp‘: Isolierte Insert- und Verktorstränge: Hitzeschock T4-DNA-Ligase Ampicillin Minipräparation

  8. Testverdau der ‚Minipräp‘: ~ 1,2 kb Verdau 4,7 kb Ansätze/ Klone Marker 4973 DB 4,7 kb 4268 ~ 1,2 kb 1375 941 Klone erfolgreich

  9. Testverau/‚Minipräp‘: Erfolgreiche Klone werden in größerem Maßstab angezüchtet Aus der sog. Maxipräparation reinigt man die Plamide auf (CsCl-Gradient) Zum Schluss: DNA-Konzentrationsbestimmung im Fotometer: (Ergebnis leider sehr niedrig, also kein Paradebeispiel)

  10. Ende: Vielen Dank! Außerdem bedanke ich mich bei ‚Wikipedia‘, aus der ich meine (umgeänderten) Abbildungen benutze.

More Related