Monomerní G proteiny

1. Monomerní G proteiny Alice Skoumalová

2. Opakování: • Chemický přenos signálu (obecná charakteristika, typy dle vzdálenosti místa ovlivnění, typy receptorů) • Příklady signálních látek • Iontový kanál • Receptor s kinázovou aktivitou • Receptor spřažený s G-proteiny

3. Přenos signálu

4. Typy membránových receptorů: 1. Iontový kanál

5. Typy membránových receptorů: 2. Receptor s kinázovou aktivitou

6. Typy membránových receptorů: 3. Receptory spřažené s G-proteiny

7. G proteiny = proteiny vázající GTP • v aktivním stavu váží GTP • regulují mnoho signálních drah a buněčných procesů • Monomerní G proteiny • = malé G proteiny nebo malé GTPázy • aktivita závisí na vázání GTP (aktivní GTP konformace, interakce s efektorem, buněčná odpověď) • katalyzují hydrolýzu terminální fosfátové skupiny (inaktivní GDP-proteiny) • Heterotrimerní G proteiny = spřažené s receptory • 3 podjednotky (α, β, γ) • α-pojednotka váže GTP,disociace a interakce s efektorem GTP

8. Malé GTPázy • GDP/GTP-regulované molekulární „přepínače“ (stav „vypnuto“ a „zapnuto“) • dva konformační stavy, zásadní pro jejich biologickou funkci: GTP-protein „zapnuto“ GDP-protein „vypnuto“ • Regulační proteiny: • GEFs (guanine nucleotide exchange factors): • urychlují výměnu nukleotidů • GAPs (GTPase-activating proteins): • urychlují GTP hydrolýzu • GDIs (guanine nucleotide dissociation inhibitors): • inhibují výměnu nukleotidů

9. Klasifikace malých GTPáz • Známo přes 150 proteinů • Ras nadrodina příbuzných proteinů, rodiny malých GTPáz: • Ras, Rab, Rho, Arf, Rad, Ran, Rheb, Rit

11. Lipidová posttranslační modifikace malých GTPáz (prenylace) • Farnesyltransferasa (Ras): kovalentní navázání C-15 farnesyl isoprenoidu (F) na cystein motivu CAAX • Geranylgeranyltransferasa I (Rho): kovalentní navázání C-20 geranylgeranyl isoprenoidu na cystein motivu CAAX • Geranylgeranyltransferasa II (Rab): kovalentní navázání C-20 geranylgeranyl isoprenoidu na cystein motivů CC, CXC, CCX, CCXXX

12. Guanine nucleotide exchange factors (GEFs) • Regulují aktivaci malých GTPáz a návaznou buněčnou odpověď • Usnadňují výměnu volného GTP za vázaný GDP

13. Různé extracelulární signály aktivují Ras pomocí aktivace odlišných Ras GEFs • Všechny Ras GEFs mají CDC25 homologickou doménu, která katalyzuje výměnu nukleotidů • Různé Ras GEFs jsou aktivovány odlišně

14. GTPase activating proteins (GAPs) • Urychlují hydrolýzu malých GTPáz • Obsahují katalytickou doménu a přídavné domény důležité pro regulaci • Mutované Ras proteiny u lidských karcinomů (substituce glycinu 12 nebo glutaminu 61) - nereagují na GAPs stimulaci - přetrvává konformace „zapnuto“ - deregulace buněčných dějů

15. Struktura malých GTPáz Funkční domény H-Ras • G doména: 4 sekvence, odpovědná za vázání GTP a GTPázovou aktivitu • Motiv CAAX: Ras a Rho • Efektorová doména: vazba s efektorem • Switch I a II: odpovědné za změnu konformace mezi GDP a GTP- proteinem • RHO sekvence

16. Různé funkce malých GTPáz Rozdílné spektrum buněčných funkcí 1. Různé GEFs a GAPs, které jsou aktivovány primárním signálem 2. Různé efektory, které vyústí v mnoho odlišných buněčných odpovědí Přehled funkcí některých malých GTPáz Ras: buněčná proliferace a diferenciace Rab, Arf, Sar: membránový transport (sekrece, endocytosa) Ran: regulátor nukleocytoplasmatického transportu Rho: cytoskelet (regulace metabolismu aktinu), buněčná morfologie, buněčný pohyb

17. Ras GTPázy Funkce: buněčná proliferace a diferenciace • Časté mutace Ras proteinů u nádorů (nejvíce studovány) • Mutace, které blokují GAPs a hydrolysu GTP, udržují Ras proteiny v poloze „zapnuto“ (nalezeny u různých tumorů)

18. Efektory Ras proteinů Ras funguje jako signální uzel 1. Konvergují v něm různé signály: Růstové faktory(epidermální růstový faktor, destičkový růstový faktor) Hormony(insulin) Cytokiny(interleukin-1) Proteiny extracelulární matrix(přes integriny) 2. Aktivuje rozdílné efektory a buněčné děje: Raf serin/threonin kináza (aktivuje Raf/Mek/Erk kinázovou kaskádu – regulace buněčného růstu) Fosfatidylinositol 3 kináza (tvorba PIP3 – regulace různých drah) Fosfolipáza Cε (tvorba druhých poslů DAG a Ca2+) GEFs jiných GTPáz (kaskády malých GTPáz – Ral, Rac, Rab)

19. Rab GTPázy (Ras homologue from brain) Funkce: membránový transport • Největší rodina malých GTPáz (minimálně 60 proteinů) • Lokalizovány v organelách zapojených do sekreční a endocytické kaskády

20. Buněčná lokalizace Rab GTPas

21. Rab proteiny a nemoci Mutace Rab genů-poruchy membránového transportu-onemocnění Griscelli syndrom (AR) • Pigmentové defekty (albinismus), porucha imunity, neurologická dysfunkce • Mutace genu Rab27a (reguluje transport melonosomů do periferie melanocytů a sekreci lytických granul v T-lymfocytech) způsobí ztrátu pigmentace a nekontrolovanou aktivaci T-lymfocytů Choroideremie (X vázaná) • Degenerace pigmentového epitelu oka • Defekt REP-1 genu (geranylgeranyl transferasa zodpovědná za prenylaci Rab27a v retinálním pigmentovém epitelu) vede k deficitu melanosomového transportu v pigmentovém epitelu a ztráta ochrany před světlem

22. Rho GTPázy • Rodina proteinů regulující metabolismus aktinu Funkce: Regulace aktinového cytoskeletu (buněčný tvar a pohyb) Modulace nejrůznějších buněčných dějů: 1. Buněčná migrace: regulace metabolismu aktinu, koordinace aktivace mnoha Rho proteinů 2. Sekrece a endocytosa: transport vesikulů 3. Proliferace a transformace: úloha je zkoumána, invaze nádorových buněk

23. Rho GTPázy Efektory Funkce v buněčné biologii RhoA, B, C ROCK I, II Aktin-myosinová kontraktilita, buněčná migrace Rac1, 2, 3 IRSp53 Polymerizace aktinu, tvorba lamelipodií, hybná síla buněčné migrace Cdc42 WASP/N-WASP Polymerizace aktinu, tvorba filopodií, sensorická úloha v buněčné migraci

24. Model Rho GTPasové aktivace efektoru Cdc42 navozená WASP aktivace a tvorba filopodií

25. Otázky Princip funkce malých GTPáz, jejich cyklus, regulace, aktivace Nejznámější rodiny malých GTPáz (funkce) Princip lipidové posttranslační modifikace Struktura malých GTPáz Důsledek mutací Ras proteinů u lidských karcinomů Funkce Rab a Rho proteinů