1 / 25

Šta je sve neophodno za ispitivanje jednog signalnog puta???

Šta je sve neophodno za ispitivanje jednog signalnog puta???. Odabrati model sistem (npr. Leydig-ove ćelije testisa pacova). Odabrati signalni put od interesa i sakupiti dovoljno literaturnih podataka o njegovim komponentama.

tate
Download Presentation

Šta je sve neophodno za ispitivanje jednog signalnog puta???

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Šta je sve neophodno za ispitivanje jednog signalnog puta??? • Odabrati model sistem (npr. Leydig-ove ćelije testisa pacova)

  2. Odabrati signalni put od interesa i sakupiti dovoljno literaturnih podataka o njegovim komponentama

  3. Koju ćemo osobinu i/ili funkciju odabranog model sistema da posmatramo pod uticajem datog signalnog puta (npr. uticaj NO-cGMP puta na biosintezu testosterona).

  4. Krenuti od genske ekspresije datog signalnog puta (ako se geni za komponente nekog signalnog puta ekspresuju u odabranoj ćeliji, zasigurno imaju i FUNKCIJU... Koju?) • METODE: • izolacija DNK i RNK • RT-PCR • RQ-PCR • agarozna elektroforeza...

  5. Ekspresija proteina (za komponente signalnog puta ILI proteine na koje dati signalni put eventualno ostvaruje svoj uticaj) • METODE: • liza ćelija i izolacija proteina • Bradfordova metoda • imunoprecipitacija • SDS-PAGE elektroforeza • Western blotting

  6. Ispitivanje nivoa sekrecije hormona ili sekundarnih glasnika, od strane ćelija gajenih u primarnoj kulturi • METODE: • RIA za merenje nivoa hormona (T+DHT, PROG i E2) • ELISA komercijalni kit za odredjivanje nivoa produkcije cAMP-a i cGMP-a

  7. PURIFIKACIJA Leydig-ovih ćelija

  8. Priprema ogleda • Autoklavirati sisteme za filtriranje medijuma i boce za čuvanje medijuma • Napraviti medijume po standardnoj recepturi i profiltrirati ih kroz prethodno autoklavirane sisteme za filtriranje (sve se izvodi u strogo sterilnim uslovima, u vertikalnom laminaru (hood-u)). Do početka ogleda ovako sterilisane rastvore čuvati u frižideru, a pred početak ogleda izvaditi ih da se temperiraju na sobnoj temperaturi (kako se ćelije ne bi „stresirale“ od hladnoće). • U hood postaviti svo plastično posudje, mrežice i ostalo što nam je potrebno za sutrašnji eksperiment. Uključiti UV lampu u hood-u! • Uključiti UV lampu, koja steriliše čitavu prostoriju u kojoj će se izvoditi ogled.

  9. IZOLACIJA TESTISA

  10. DEKAPSULACIJA TESTISA

  11. TESTISI U MEDIJUMU SA KOLAGENAZOM

  12. INKUBACIJA U VODENOM KUPATILU

  13. INKUBACIJA U VODENOM KUPATILU

  14. DODAVANJE HLADNOG MEDIJUMA I FILTRIRANJE KROZ MREŽICE

  15. FILTRIRANJE KROZ MREŽICE

  16. CENTRIFUGIRANJE

  17. BROJANJE IC

  18. NASLOJAVANJE PERKOLA

  19. NASLOJAVANJE SUSPENZIJE IC NA KOLONE

  20. NASLOJAVANA SUSPENZIJA IC NA KOLONE

  21. PURIFIKOVANE LC NAKON CENTRIFUGIRANJA

  22. SAKUPLJANJE FRAKCIJE LC

  23. DOPUNJAVANJE FALKONA OD 50ml MEDIJUMOM (ISPIRANJE) • CENTRIFUGIRANJE • RESUSPENDOVANJE TALOGA U MEDIJUMU • BROJANJE PURIFIKOVANIH LC

  24. SAĐENJE • STIMULACIJA

  25. Hvala na pažnji !!! :)

More Related