Szalontai Gábor 2010 február

1. NMR spektroszkópia(vegyész mesterkurzus: VEMKSI 4312S)Polarizáció-átvitel dipolárisan csatolt magok között: - mag Overhauser hatás (NOE)- csere-spektroszkópia (DNMR) Szalontai Gábor 2010 február

2. Cél = térszerkezet vizsgálat = mágnesezettség-átvitel = polarizáció-átvitel • Magtávolságok becslése, mérése • Érzékenységnövelés (13C, 29Si, …103Rh, stb. magok mérése) • Segítség a hozzárendelésben

3. Mágnesezettség (polarizáció) átvitel: eredendő jelerősség (1H vs. 13C magpár) négyszer annyi proton mag van az alsó szinten mint a 13C !  a proton négyszer olyan erős dipólmint a 13C !  a protonok négyszer olyan gyorsan precesszálnakmint a 13C -k! tehát 4*4*4 = 64 = g3 -szor erősebb lesz a proton jele! Ráadásul: mivel a 13C természetes előfordulás csak 1,1 %. 

4. Besugárzott mag : 1H

5. Emlékeztető (1): a relaxáció és mérése Inverzió 180o(x) Beolvasás 90o(x) Az inverzió (átfordítás) óta eltelt t idő

6. Emlékeztető (2): a relaxációs mechanizmusok Csak a dipoláris mechanizmus felelős a NOE effektusért!

7. Eltérő méretű molekulák (a-CD és etanol (ms= 46 ) keverék) relaxációja t megfelelő megválasztásá-val elérhető, hogy csak a gyorsabban relaxáló molekula (esetünkben az a-Ciklodextrin ms=974) jelei látszanak!

8. Cyclodextrins: (-D-glucopyranose)-n OH (3) OH (2) 2 3 5 1 4 CH2-OH (6) a-CD : 174Å3b-CD : 262Å3 g-CD : 427 Å3

9. A magi (nuclear) Overhauser (NOE) jelenség: szelektív vagy szélessávú besugárzás hatására bizonyos magok jeleinek intenzitása megváltozik !!!(eredetileg elektron-mag párokon tapasztalta Overhauser)

10. NOE jelenség: végy egy dipolárisan csatolt I,S magpárt (DIS > 0 Hz) (4N mag): alkalmazz szelektív telítést (S) bb N - d S = w1S I = w1I ab N ba N I = w1I S = w1S aa N + d bb N - d/2 S = w1S I = w1I ab N-d/2 ba N +d/2 I = w1I S = w1S aa N + d/2

11. A NOE lényege: S besugárzása következtében fellépő I betöltöttség-szint változás (inkoherens polarizáció-átvitel) A NOE mértéke: W0, W1 és W2 a zéró-, egy- és két-kvantumos relaxációs folyamatok valószínűségét jelentik

12. NOE = f(relaxációs szintek = 1/w) = hs(I) Az átmenetek valószínűsége a szintek betöltöttség-különbségével arányos, az egy-kvantumos átmenet esetén ez: Ahol r az I és S magok távolsága tC a molekuláris korrelációs idő wI és wS az I és S magok Larmor frekvenciái

13. NOE = f(relaxációs szintek = 1/w) = hs(I) Az átmenetek valószínűsége a szintek betöltöttség-különbségével arányos, a zéró-kvantumos átmenet esetén ez: Ahol r az I és S magok távolsága tC a molekuláris korrelációs idő wI és wS az I és S magok Larmor frekvenciái

14. NOE = f(relaxációs szintek = 1/w) = hs(I) Az átmenetek valószínűsége a szintek betöltöttség-különbségével arányos, a két-kvantumos átmenet esetén ez: Ahol r az I és S magok távolsága tC a molekuláris korrelációs idő wI és wS az I és S magok Larmor frekvenciái

15. Egy-éstöbb-kvantumkoherenciák: egyszerűsített fizikai kép (AX rendszer) SQ: DM= +/- 1, ezek észlelhetőek... A X MQ: DM= +/- 2, 3, ...mindig antifázisúak és emiatt nem észlelhetőek... nA + nX

16. Több-kvantum koherenciák tulajdonságai • A rendűséggel (p) arányosan változnak az átmenetek frekvenciái (p*f1). Ahol f1= a gerjesztő rf tér frekvenciája. • Ennek megfelelően változnak a fáziscsúszások is a gerjesztő impulzus szögéhez képest (p*f1)… • A zéró-kvantumos átmenetek függetlenek ettől a hatástól. • Gerjesztési eljárás: 90o-t-180o-t-90o (p=2, 4, 6, ...stb)

17. A homonukleáris NOE (ha w2t22 << 1) maximális értéke Független a két mag távolságától!!? W0, W1 és W2 a zéró, egy és két-kvantumos folyamatok valószínűségét jelentik

18. A heteronukleáris NOE (ha w2t22 << 1) maximális értéke W0, W1 és W2 a zéró, egy és két-kvantumos folyamatok valószínűségét jelentik

19. 1. feltétel Olyan molekuláris mozgások megléte, amelyek frekvenciája a Larmor frekvenciák tartományába esik.

20. A molekuláris mozgásokáltal keltett frekvenciák az eltérő eredetű lokális mágneses tereket (2. feltétel) mozgatva vezetnek az eltérő relaxációs mechanizmusok-hoz …

21. A NOE függése a molekuláris mozgásoktól: a molekulaméret, az oldószer (viszkozitás), és a hőmérséklet hatása NOE maximum mw = 1000-2000 között W2~ W0 ROESY 0,5 wtC >> 1 mw > 2000 W2< W0 wtC << 1 kis és közepes molekulák W2> W0 -1,0 NOESY

22. A mért NOE-kból számolható (becsülhető) magtávolságokKét-spin esetek: ahol p* = egyéb egykvantumos dipoláris relaxációs hozzájárulás tC = molekuláris korrelációs idő Relatív magtávolságok két eltérő molekulán mért NOE értékek alapján csak akkor összevethetőek, ha .... tC azonos a két mintában teljesül a w2t2C << 1 feltétel p* közel azonos a két molekulában Több-spin esetek egy molekulán belül: hA(B) = hC(B) = 0,5 is lehet! A növekedés léte még nem elegendő bizonyíték a két mag „közelségére” ... A növekedés hiánya még nem elegendő bizonyíték a két mag „távoliságára” ...

23. Egyensúlyi NOE hatások mérése : kvázi folyamatos besugárzással egy új egyensúly jön létre! A NOE felépülést mérő eljárások: a besugárzás időtartama rövid a relaxáció idejéhez képest!

24. "Tranziens" NOE-k mérése egy dimenzióban: a besugárzás szelektív és sokkal rövidebb mint a relaxációs időállandó! pulzus o 90 1 o H 180 "kemény" akvizició t NOE felépülési szintet mér, ami 6 ~ r IS a kiválasztott átmenet szelektív o átfordítása egy 180 -os pulzussal "Tranziens" NOE-k mérése két dimenzióban (NOESY kísérlet) pulzus o o o 90 90 90 akvizició t M t 1 6 t f( ~ r M) IS keveredési idõ ~ T 1

25. Emlékeztető: a kettős-rezonancia kísérletek (B1, B2) (I) Szelektív spin-lecsatolás: B2 = lecsatoló tér

26. Kettős-rezonancia kísérletek (II)Szélessávú protonlecsatolás X {1H}: fenn: normál X spektrum {1H} középen: protoncsatolt X spektrum lenn: NOE nélküli X spektrum (mennyiségi kiértékelés)

27. Homonukleáris NOE kísérlet: Ez is szelektív besugárzás: B2 = szelektív tér Heteronukleáris NOE kísérlet: 13C{1H} 31P{1H} 15N{1H} 29Si{1H} hmax= 0,5*gH/gX 1,98 1,14 -2,94 -0,52

28. 2D eljárások: tranziens NOE mérése a molekula összes magja között: NOESY = DQF-COSY tm keveredési idő t2 állandó t1változó 90o(x) 90o(x) B1(90o)x Mz=Mcos2pnt1 COSY Mx=Msin2pnt1 NOESY B1(90o)x

29. NOESY: nem kívánt mellékhatások, egyéb komplikációk • A NOE csak a z-mágnesezettséget befolyásolja (zéró rendű, ZQC), tehát érzéketlen az rf impulzusok fázisára (a fázisléptetésre immunis!) • Zéró rendű koherenciák azonban létrejönnek a (NOESY= DQF-COSY) szekvenciában a J-csatolt magpárok között is! Ezektől kell megszabadulni, hiszen ezek COSY keresztcsúcsokat produkálnak! a COSY eredetű zeró kvantumos (ZQC) koherenciák intenzitás változásai Dtmkis mértékű, véletlenszerű változtatása törli a COSY eredetű keresztcsúcsokat! NOE Dtm keveredési idő, tm

30. A keveredési idő, tm helyes megválasztása: mennyi időt hagyjunk az átvitelre? NOESY keresztcsúcs intenzitások kis molekulák: gyors molekuláris mozgás A kísérlet kulcsa Dtm helyes megválasztása: kis molekulák (< 500 D) esetében a becsült T1 körüli (0.5 – 2.0 s) érték általában megfelelő. Nagyobb molekulák esetében (1000-2000 D között) a jel elveszhet. Igazán nagy molekulák (a negatív NOE-k tartománya) esetén 0.5*T1 az ajánlott érték! keveredési idő, tm nagy molekulák, viszkózus oldatok: lassú molekuláris mozgás

31. Tranziens NOE: kinetika, mérés a lineáris növekedés tartományában NOE ~ 1/rIS-6 NOE NOE(S) = k’ *rIS-6*tC a lineáris növekedés tartományában a magok izolált spin-párként viselkednek, ezt lehet kihasználni a távolság mérésére NOE= kereszt-relaxációs szint Dtm

32. Alkalmazási példák: magtávolság, rAB mérés - ha a molekuláris korrelációs idő, tc ismert, rAB közvetlenül számolható (tc meghatározható pl. a 13C relaxációs idő mérésekből) - gyakoribb megoldás egy ismert rXY referencia távolság használata (pl. két metilén proton távolsága állandónak tekinthető ~1.4 Å) ηA(B)/ηX(Y) = rAB-6 / rXY-6 Figyelem: dinamikus átlagot kapunk!

33. 2D eljárások: NOESY példák (cyclosporin, undecapeptide, C6D6) Gradiens-segített fázisérzékeny NOESY A keresztcsúcsok fázisa ellentétes a diagonálison levőkhöz képest (csak a pozitív NOE tartományban mw < 1000 ) A kémiai csere (lásd később) viszont a diagonálissal azonos fázisú jeleket hoz létre, ennek alapján ezek könnyen megkülönböztethetőek!

34. 2D eljárás: NOESY példák (pravastatin, noesygpph) Gradiens-segített fázisérzékeny NOESY A keresztcsúcsok fázisa azonos a diagonálison levőkhöz képest (csak a negatívNOE tartományban van így !! mw = 409 )

35. 2D eljárások: NOESY példák (szekvencia: noesygpph) 31P-31P térbeli korreláció NOESYGPPH szélessávú proton lecsatolással: Csak a 195Pt -31P szatellit jelei mutatnak egymással keresztcsúcsokat, ezek feltehetően a 195Pt spin-állapotváltozásai (relaxáció) miatt fellépő csere-keresztcsúcsok! A fázisuk megegyezik a diagonálison lévő jelekével! A főcsúcsok (a 193Pt-hoz kötött 31P magok) nem mutatnak térbeli közelséget vagy cserét!

36. 1D NOESY szekvenciák: differencia spektroszkópia tm keveredési idő t2 állandó 90o(x) 180o(x) szelektív impulzus Általában pontos mag távolság meghatározásra használják, több keveredési idővel veszik fel a spektrumokat, amelyek egy referencia („üres” helyen gerjesztett) spektrumot is magukba foglalnak ... A differencia –spektroszkópia összes hátránya jelen van!

37. (Double) Pulse Field Gradient Spin Echo: • kiválasztja (gerjeszti) a kérdéses rezonanciát és csak az ebből származó polarizációt tartja meg, a többit a gradiensek szétszórják! Csak a növekedést mutatja ott, ahova a polarizáció került differencia spektroszkópia nélkül! • A viszonylag hosszú tm (>300 ms) alatt a „szétszórt” mágnesezettség is relaxál, ezért nem kívánatos z-komponensek jelennek meg, ezeket egy négylépéses fázisciklus (EXORCYCLE) kiszűri, mert nem teljes, hanem csak kis jelekről van szó. 1D gradiens NOESY tm keveredési idő 180o(x) szelektív impulzus 90o(x) 180o(x) szelektív impulzusok 90o(x) 90o(x) 90o(x) z-gradiensek Shaka et al. J.Magn.Res. 125, 302-324 (1997)

38. Tranziensvs.egyensúlyi NOE • a növekedés igen erősen függ a használt keveredési (csere) időtől, • a növekedés függ a kiválasztott (besugárzott) jel inverziójának (átfordításának) pontosságától is, • a százalékos növekedés számítása nem egyszerű, az átfordított jel itt nem használható egyszerű referenciaként és az inverziót is skálázni kell 100 %-ra, • a növekedés százalékos abszolút értéke kisebb lesz mint az egyensúlyi NOE esetében, de általában jobban észlelhető!

39. Tranziens vs. egyensúlyi NOE: 1D példák (1) pravastatin (tranziens NOE) (180o, GAUSS 1.100) szelektív besugárzás: 88 ms, 67 dB, gerjesztett tartomány kb. 25 Hz A fázisciklus miatt fellépő kivonási maradék (selnogp szekvencia)

40. Tranziens vs. egyensúlyi NOE: 1D példák (2) : (egyensúlyi példa)

41. Hereonukleáris NOE Heteronukleáris NOE kísérlet: 13C{1H} 1P{1H} 15N{1H} 29Si{1H} hmax= 0,5*gH/gX 1,98 1,14 -2,94 -0,52 Azonos elvi alapon működik, az elérhető NOE maximum értékét a választott magpár giromágneses állandóinak aránya határozza meg!

42. NOESY vs. ROESY NOE maximum mw = 1000-2000 között W2~ W0 ROESY 0,5 ROESY Az átmeneti tartományban a leghasznosabb, ahol a NOESY keresztcsúcsok nagyon kicsik, változó előjelűek vagy teljesen hiányoznak!! wtC >> 1 mw > 2000 W2< W0 wtC << 1 kis és közepes molekulák W2> W0 -1,0 NOESY

43. ROtating framenoE SpectroscopY • A hagyományos NOESY mérés (z polarizáció változást mérünk) legnagyobb problémája, hogy wotC ~ 1 közelében (1000- 2000 D) nincs jól mérhető jel! • Viszont a spin-lock tér* (transzverz polarizáció létezik) körülményei között a molekula méretétől függetlenül gyakorlatilag csak növekedés van , nagy molekulákra a maximális ROE érték az elméleti NOE kétszerese! Lásd a kereszt-polarizációra vonatkozó alábbi összefüggést!

44. ROESY: a hagyományos 1D eljárás tm keveredési idő 90o(x) t2 (állandó) 180o(x) szelektív impulzus gB1 << gBo tehát w1tC << 1 Az ún. spin-lock tér (B1) ideje alatt (keveredési idő) változnak meg a Z-szint betöltöttségek a dipolárisan csatolt magok között!

45. ROtating framenoE SpectroscopY: mit jelent a forgó koord. rendszer és a spin-lock tér? • Spin-lock tér: a Hartmann-Hahn feltétel teljesülése alatt a mágnesezettség az Y-tengely mentén helyezkedik el … 180o(x) szelektív impulzus 90o(x) szélessávú gerjesztés NOE kísérlet a forgó koordináta rendszerben: ROE (tranzverzális) tranziens NOE kísérlet: (longitudionális)

46. Rotating-frame Overhauser SpectroscopY: 2D tm spin-lockkeveredési idő 90o(x) t1idő Spin-lock tér y A protonok azonos effektív teret éreznek, csak a homonukleáris csatolások aktívak, így oszcilláló (oda-vissza) polarizáció-átvitel játszódik le a J-csatolt spinek között!! 180o(y) d d Spin-lock tér y (homonukleáris spin-echo kísérlet) n

47. ROESY: a hagyományos 2D eljárás tm keveredési idő 90o(x) t2 (állandó) t1 CW gB1 << gBo tehát w1tC << 1 Az ún. spin-lock tér (B1) ideje alatt (keveredési idő) változnak meg a Z-szint betöltöttségek a dipolárisan csatolt magok között!

48. Rotating-frame Overhauser SpectroscopY: zavaró jelek • COSY keresztcsúcsok • TOCSY átvitel a J-csatolt magok között • rf off-rezonancia hatások miatt jelgyengülés lép fel

49. ROESY vs. NOESY : pravastatin só mw= 409 (anion)

50. ROESY pravastatin 400 ms DMSO ns=8 t=5 h d1=4s TD=512 (F1) A keresztcsúcsok fázisa ellentétes a diagonálison lévő jelekével! Kivéve a kémiai csere következtében fellépő keresztcsúcsokat!