Empreinte génétique des souches de Mycobacterium tuberculosis

1. Empreinte génétique des souches de Mycobacterium tuberculosis Professeur Férièle MESSADI-AKROUT Laboratoire Régional d’Hygiène E.P.S. Hédi CHAKER de Sfax

2. RFLP • Restriction Fragment Length Polymorphism • Technique basée sur la détection des éléments d’insertion • IS 6110 • Met en évidence les polymorphismes des mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis • Permet d’obtenir les profils (empreintes) génétiques ou • « fingerprints » des souches, les distinguant ainsi entre elles • Outil fiable pour des études épidémiologiques : • sur les sources d’infection • Les chaînes de transmission • Identification de miniépidémies multirésistantes

3. Le nombre de copies et le site d’insertion dans le chromosome : variables d’une souche à l’autre • relative instabilité de cet élément génétique • Polymorphisme des profils d’IS 6110 est expliqué par: • Le nombre et les différentes positions des IS dans le chromosome • La taille des fragments de restriction dépendant des sites de restriction adjacents aux IS Transposition : événement extrêmement rare

4. MATERIEL • 237 souches de M. tuberculosis provenant 226 patients • Fin 1992 et 1993 dans 12 hôpitaux tunisiens • 74 % de sexe masculin

5. PROVENANCE DES SOUCHES

6. TYPES DELOCALISATION • 93 % d’origine pulmonaire • 7 % d’origine extra-pulmonaire : • urine 0,4 % • ponction lombaire 0,4 % • biopsie 0,8 % • pus 3,3 % • autres ponctions 2,1 %

7. Étude de la sensibilité des souches aux anti-tuberculeux technique des proportions Canetti et al. • Fiche de renseignement complétée à partir des dossiers médicaux et enquêtes épidémiologiques effectuées par DSSB. • Résistance primaire • Résistance secondaire

8. METHODES Technique RFLP: méthode décrite par Van Embden et al Institut National de Santé Publique et de Protection de l’Environnement Bilthoven Neederland

9. 1. Extraction ADN génomique des mycobactéries • culture bactérienne Tampon Tris EDTA (pH 8) • mycobactéries tuées par la chaleur (20 mn à 80°C). Digestion par lysozyme (1mg/ml) lyse des parois mycobactériennes • Ajout protéinase K, SDS (dénaturation des protéines) 10 mn à 65° C • Ajout NaCl (0,6M) CTAB (cétylNNN Triméthylammonium Bromide). Séparation des protéines et des ac. Nucléiques • Ajout chloroforme – Isoamylalcool permet extraction ADN (phase aqueuse) : • Précipitation ADN avec isopropanol

10. 2. Digestion ADN avec une enzyme de restriction Pvu II(endonucléase) (Boehringer Mannheim Allemagne) Reconnaît la séquence palindromique CAG |CTG Coupe une seule fois dans IS 6110 et en dehors à distances variables

11. 3. Électrophorèse sur gel d’agarose (0,8 %) Fragments d’ADN digérés sont séparés selon leur taille 4. Southern blotting transfert fragments ADN sur membrane de nitrocellulose 5. Préparation de la sonde par PCR

12. 6. Hybridation avec sonde marquée à la peroxydase (245 pb) 7. Détection par technique chimique non radio active ( ECL: Enhanced ChemiLuminescence) 8. Analyse des profils par ordinateur avec le logiciel Gel compar . ( RIVM Bilthoven, Hollande) Coefficient de similitude entre les différents profils Poids moléculaires et intensité des bandes Dendrogramme

15. RESULTATS Nombre de copies IS 6110 varie de 3 à 22 Majorité des souches ont entre 7 et 15 copies (91,1 %) % Nombre de copies IS 6110

16. Analyse de profils génétiques montre par ordinateur une faible hétérogénéité. 72 % des souches sont regroupées dans 3 « clusters » qui contiennent plus de 10 copies IS 6110 souches proviennent de 3 clones Souches africaines moins polymorphiques que souches néerlandaises

17. Souches Tunisiennes

18. Souches Néerlandaises

19. Degré de polymorphisme plus faible Pays à haute prévalence Pays à basse prévalence Taux de transmission plus Important Réactivation endogène Infection récente

20. Il n’existe pas de relation entre le profil RFLP et l’acquisition de résistance par les souches de M. tuberculosis • Analyse du profil RFLP permet : • d’identifier des miniépidémies (souches résistantes ou sensibles) • d’analyser les circonstances de la transmission (infections nosocomiales) • d’aider à la définition des mesures à prendre pour éviter ce type d’accident • Il n’existe pas de souches ne possédant pas IS 6110 comme celles décrites par Yuen sur des souches vietnamiennes

21. Au niveau des 3 groupes RFLP principaux: • pas possibilité d’associer un profil à une origine géographique particulière • Mobilité importante de la population • Comparaison aux souches éthiopiennes: • Aucun profil comparable, ceci confirme l’hypothèse d’une possible différenciation par l’origine géographique • Comparaison aux souches néerlandaises: Profil similaire chez un chauffeur transportant des animaux en Tunisie et au Maroc Infection probablement contractée en Tunisie

22. Intérêt de la mise en placed’une collection de souches provenant du monde entier et présentant des caractéristiques différentes de manière à pouvoir associer à des profils particuliers une origine géographique et peut être des caractères de pathogénicité et de résistance aux antituberculeux

23. Différents prélèvements provenant du même patient même profil RFLP Malgré polymorphisme des souches de M.tuberculosis. Phénomène de transposition : rare • Deux prélèvements pulmonaires et une ponction ganglionnaire provenant d’un même patient Profils identiques sites pulmonaires Profil différent pour le site ganglionnaire mais similaire avec une bande en plus rare phénomène de transposition Plutôt que d’une infection par 2 souches différentes

25. La transmission intra familiale de la tuberculose a été démontrée dans 2 cas : - 2 frères de Ksar Helal même profil génétique - 1 frère et une sœur de Sousse même profil génétique • 3 souches multirésistantes isolées chez 3 patients de  régions (Ariana, Sousse, Sfax) même profil RFLP PCR Innolipa Rif-TB Test même type de mutation (R2) sur le gène rpo B (responsable de la résistance à la Rifampicine) • Source commune d’infection, transmission de souche M D R

26. 3 souches présentant une résistance à l’isoniazide (Rce primaire)  même profil RFLP.

27. 3 patients résidant dans 3 villes proche de Menzel Bourguiba (Nefza, Mateur, Bizerte) • pas de contact démontré • Source commune d’infection • - même lieu • - même bar (narguilé) • Détection de contaminations intra laboratoires : 8 sujets ne présentant aucun signe radiologique ni clinique de tuberculose ont un profil identique à d’autres souches isolées le même jour dans le même laboratoire.

29. Souche isolée chez une technicienne de laboratoire identique à celle d’un autre patient. investigations épidémiologiques plus approfondies infection au laboratoire possible

30. CONCLUSION • Technique RFLP : Existence de 3 grands groupes mettant en évidence un taux de transmission important • Malgré le faible degré de polymorphisme, aucune relation retrouvée entre: • les 3 différents clusters • l’âge • le tropisme des tissus • origine géographique

31. A mis en évidence : • Des contaminations de laboratoire • Recherche de source d’infection • Association RFLP et résistance primaire • RFLP méthode de référence : • Différenciation réinfection et rechute • Établir la transmission de souches sensibles ou résistantes • Déterminer la nature nosocomiale d’une épidémie • Surveillance de la résistance primaire et secondaire couplée à l’analyse RFLP devrait être poursuivie à long terme afin d’évaluer la performance du traitement antituberculeux

32. Merci pour votre attention