UE d’Hématopoïèse

1. UE d’Hématopoïèse Les antagonistes du récepteur aux hydrocarbures aromatiques (AhR) amplifient l’accroissement des cellules hématopoïétiques humaines Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

2. Hématopoïèse Introduction Résultats expérimentaux Mécanisme d’action et voie AhR Conclusion Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

3. But: améliorer les transplants de cellules souches hématopoïétiques (CSH). Actuellement très utilisés ; mais problème de compatibilité HLA pour les allogreffes. Alternative: sang de cordon, mais souvent nombre d’unités/cordon relativement faible (NB: on peut cumuler deux sangs de cordon pour avoir une greffe acceptable) A l’instar de l’insuline pour les diabétiques, il serait cependant intéressant de pouvoir les produire in vivo, et les synthétiser in fine ex vivo. Problème: trouver un milieu de culture adapté. Introduction Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

4. Différents types de greffe: • Allogreffe: donneur ≠ receveur, mais HLA-compatible • Autogreffe: cellules mises en banque pour être réutilisées par le donneur Introduction - rappel • Provenance des CSHs: • Cellules souches de sang périphérique (Cytaphérèse) • Sang de cordon • Moelle osseuse Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

5. Ex-vivo, les cultures « traditionnelles » (sérum libre, thrombopoïétine, Stem Cell Factor, Flt3-Ligand et IL-6), efficientes in vivo, donnent bien une prolifération-différenciation ici, mais durant cette dernière les cellules perdent leurs antigènes spécifiques de surface… (CD34 et CD133) Introduction - cultures Une équipe a donc passé au crible plus de 100.000 molécules susceptibles de proliférer-se différencier tout en conservant les marqueurs cellulaires (cellules CD34+ et CD133+)… Parmi elles, SR-1 semble la plus prometteuse. CSH CD133 CD34 Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

6. SR1 • Identification • Structure • A long terme et effet dose • Cellules de cordon • Réversibilité • ≠ animaux et effet antiprolifératif • Total des cellules nucléées • Rôle sur la division • Lignées • Greffe • Organes (répartition) • Double greffe Résultats expérimentaux Remarque préalable : le DMSO est un simple solvant, utilisé comme témoin. Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

7. Expression de CD34 et de CD133 en culture en microscopie confocale SR1 – identification Hoechst: colore noyaux. Dans la culture contrôle, les cellules perdent leurs marqueurs ■ SR1 ● DMSO • Dans la culture SR1: • Les cellules prolifèrent • Les CD34 et 133 persistent Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

8. Stemregenin – 1 (SR1) Hétérocycle dérivé purique substitué en 2, 6 et 9 SR1 - structure 2 6 9 Analogue moins puissant Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

9. J7 A long terme: J21 SR1 => L’expression des protéines perdure Effet dose: => L’efficacité de SR1 est dose-dépendante Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

10. Mise en culture de 1000 cellules (souches ou progéniteurs) dérivés du sang de cordon SR1 – cellules de cordon Résultats après 21 jours, en cytométrie en flux Fold = [SR1]1µM /[DMSO] Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

11. Après lavage, et remise en culture sans SR1, l’expression de CD34 chute et rejoint celle de DMSO SR1 - réversibilité ■ SR1 ● DMSO => L’effet de SR1 est réversible Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

12. 14 jours de culture /!\ Représentation des doses à échelle logarithmique SR1: ≠ animaux et dose max ■ Cynomolgus ● Rhésus ▲ Chien Dose maximale efficace pour [SR1] = 1 µM Effet antiprolifératif si [SR1] > 1 µM Aucun effet sur ¢ murines (souris) Uniquement ¢ humaines, simiennes et canines Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

13. Culture de 1000 cellules CD34+ de sang de cordon, en SR1 (noir) ou contrôle (blanc). SR1 - TNCs Le total de cellules nucléées augmente de façon très importante. Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

14. Utilisation du CFSE, colorant fluorescent marquant les divisions cellulaires SR1: division symétrique? Mais très bonne conservation des CD34+!! SR1 DMSO SR1 ≈ DMSO => Pas de rôle dans la division… Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

15. SR1 - lignées Augmentation du nombre de néocolonies (CFUs): • Simple myéloïde • Simple érythroïde • Bipotentiel granulocyte/monocyte • Multilignée granulocytaire-érythrocytaire-monocytaire-mégacariocytaire.. avec SR1 seul!! => Soit un accroissement des progéniteurs multipotants précoces Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

16. A SR1: greffe Mise en culture de 250.000 ¢ CD34+ de sang de cordon pendant 3 semaines Greffe de 300 ou 10.000 ¢ sur souris NOD-SCID (immunodéprimées) Sang après 8 semaines Moelle osseuse 13 semaines => A partir d’un nombre restreint de ¢, la greffe prend de manière précoce et soutenue avec SR1 Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

17. La répartition par organe (Moelle osseuse, rate, thymus) est sensiblement équivalente, SR1 ou non. SR1 – organes Au dessus: sans SR1 En dessous: avec SR1 Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

18. A B SR1: double greffe Greffe primaire A Greffe secondaire B SRC (NOD-SCID RepopulatingCells) : cellules humaines capables de reconstitution hématopoïétique = cellules humaines viables après greffe chez la souris Les SRC en culture avec SR1 supportent jusqu’à 7 nouvelles transplantations indépendantes !! Transplantation d’une fraction de la culture finale précédente Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

19. Confrontation de SR1 et de 61 protéines kinases (effecteurs): aucune activité inhibitrice significative trouvée… => Pas de rôle direct SR1: mécanisme d’action En revanche… Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

20. En comparant SR1 avec son analogue LGC006, 2 gènes-cibles apparaissent très réprimés par l’un et non par l’autre. SR1: mécanisme d’action SR1 LGC006 CYP1B1 AHRR Ces deux gènes sont régulés via un mécanisme de signalisation complexe basé sur AhR… Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

21. Récepteur de nature phosphoprotéique. Possède un domaine PAS + structure hélice/boucle/hélice (sans doigt de zinc), et un domaine riche en glutamine pour se lier à l’ADN AhR Absence de ligand: AHR quiescent dans le cytosol, complexé à 2 HSP90 masquant HBH et PAS Présence de ligands exogènes => phosphorylé par la pkC/Tyr, détache HSPs, forme un hétérodimère avec Arnt (AHR nucleartranslocator) => noyau => gènes => domaines XRE (en 5’ des cytochromes P450: leurs substrats = ligands de AhR! Ex: TCDD, une dioxine) Théoriquement bon: détoxifie. En pratique: produits de la détoxification à effets cancérigènes… Répresseur compétitif : Protéine AHRR (AHR-repressor) localisé dans le noyau interagissant avec Arnt. Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

22. L HSP90 Arnt AhR-CYP450 Bloqué ici si SR1 Ligand AhR Gène -> ARN -> protéine cytochrome P450 Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

23. L HSP90 Arnt AhR-AhRR Ligand AhR Gène-ARN-protéine répresseur AHRR AhRR Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

24. La luciférase sert de gène rapporteur: C’est une enzyme trouvée chez la luciole, dont l’activité émet de la lumière. En insérant l’ADN codant pour cette enzyme à côté du gène qui nous intéresse, on en fait un gène rapporteur permettant de quantifier l’activité du gène-cible. SR1 – antagoniste d’AhR Avec SR1, le taux de transcription des gènes-cibles d’AhR s’effondre!! => Activité antagoniste d’AhR par action/gènes cibles ● SR1 ■ DMSO Spécificité humaine SR1 n’a que très peu d’effet chez la souris, mais est très efficace pour inhiber chez l’Homme Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

25. Prouver le rôle direct de SR1 sur les récepteurs nucléaires d’AhR SR1 – inhibition directe Le domaine PAS a une phylogénie très particulière: chez les animaux inférieurs, sa seule fonction est la régulation circadienne (cycles jours/nuits). Ce rôle existe encore chez l’Homme et peut être mis à profit… • On met en présence : • PAL (le ligand à photoaffinité pouvant se fixer sur PAS) • Indirubine, dont la fixation à PAL est connue • SR1 (fixation à démontrer) • LGC006 (l’analogue moins puissant de SR1) La chromatographie, confirmée par la courbe, révèle que contrairement à LGC006, SR1 s’est lié à tous les PAL (qui n’apparaissent plus) de façon équivalente à l’indirubine. => Par analogie, SR1 fonctionne bien par fixation directe sur PAS Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

26. Il reste encore à expliquer de quelle façon AhR est lié avec l’hématopoïèse. Rôle d’AhR sur l’induction de SR1 • Des cellules de cordon CD34+ ont été infectées avec des lentivirus (rétrovirus) exprimant : • la protéine fluorescente verte GFP (permettant de les voir..) • shRNAs ciblant et inactivant AHR Dans les cellules CD34+GFP+, shRNA conduit à la diminution de l’ARNm d’AHR et de son expression protéique, et conserve CD34 pendant la culture. = > l’inactivation d’AhR a des effets similaires à SR1 Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

27. Mais, les effets de SR1 nécessitent ils l’inactivation d’AhR? AhR KD Une version d’AhR privée (Knock-Down) du domaine de fixation pour le ligand a été créé, baptisée CA-AhR.. SR1 ne réussit plus à inhiber l’activité de la luciférase (qui permettait de contrôler l’expression des gènes cibles), et n’a plus aucun effet sur les cellules CD34+ de sang de cordon!! => Cela prouve bien qu’SR1 nécessite une fixation à AhR (en l’occurrence celle du ligand), et qu’il augmente le taux de CD34+ des cellules de cordon. Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

28. La présence d’AhR a été démontrée dans les cellules hématopoïétiques. Son rôle de facteur de transcription activé par un ligand et induisant des enzymes métabolisant des drogues a pu être ici redémontré Conclusion • Mais AhR est aussi impliqué dans des voies de régulations de l’hématopoïèse: • HES1 • c-MYC • C/EBP • PU.1 • β-caténine • CXCR4 • STAT5 Un traitement TCDD (dioxine) des souris donneuses entraîne une diminution de l’activité de reconstitution du pool des cellules Lin-cKit+Sca-1+ (= cellules souches) Reste encore à définir les mécanismes impliqués dans ces processus. Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

29. SR1 augmente le nombre des cellules souches • SR1 et les KD AhR maintiennent l’expression de CD34 • SR1 permet la formation de nouvelles colonies multilignée • AHR empêche les cellules souches de prendre en greffe en les empêchant de se différencier. • Cependant, il n’est pas encore possible d’exclure l’existence de mécanismes alternatifs: il faudrait de meilleurs marqueurs spécifiques des cellules souches humaines, ainsi que des études cliniques. Conclusion Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

30. Des études complémentaires à celle-ci avaient été réalisées par la même équipe, essayant soit d’améliorer l’accroissement des cellules souches (angiopoïétine, gènes HOX, chélateurs du cuivre…), soit leur capacité de « Homing » (Prostaglandine E2, fucosylation…) Cette étude-ci permettra, après avoir exploré le potentiel clinique de SR1, d’améliorer le rendement des transplantations et trouver d’autres applications des transplantations autologues ou allogéniques. Ouverture Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas

31. Bibliographie http://www.academie-veterinaire-defrance.org/bulletin/pdf/2003Numero3/37.pdf http://www.ssents.uvsq.fr/spip.php?article42 http://molpharm.aspetjournals.org/content/69/1/140 Dr. Jean-Noël Bastie Pr. Gaëtan Jeggo POULET Alexandre MICHEL Nicolas