DNA É O MATERIAL GENÉTICO: TOPOLOGIA DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS

1. DNA É O MATERIAL GENÉTICO: TOPOLOGIA DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS

2. A informação guardada nos genes é transmitida milhões de vezes em forma inalterada durante a vida de um organismo multicelular! • Que tipo de molécula seria capaz de sustentar tal numero de exatas replicações e dirigir o desenvolvimento de um organismo  • Que tipo de instruções carrega a informação genética • Como a imensa quantidade de instruções são fisicamente organizadas de tal forma que possam ser contidas dentro de uma célula • Algumas respostas começaram a emergir nos 40s, estudos com fungos onde se viu que informação consistia de instruções para fazer proteínas e que estas ultimas eram as responsáveis pelas propriedades e funções da célula. • A informação pode passar de duas formas para a geração seguinte, pelo ovo fertilizado • (na reprodução sexual) ou para a célula filha (na reprodução asexual). • Um particular fato na estrutura do DNA é que esta é independente da seqüência de nt. • Relação entre a seqüência de DNA e a seqüência correspondente da proteína: código genético

3. Descobrimento do DNA Histórico

4. Histórico ( cont.) • 1865 – Johann Gregor Mendel • Publicou resultados dos cruzamentos de ervilhas Pisum sativum. • Noticiou o aparecimento e desaparecimento de características em vagens e flores em várias gerações. • Postulou as regras que governam a hereditariedade. • Propôs a existência de discretas unidades de hereditariedade (genes), que seriam transmitidas de geração para geração. • 1869 – Johann Friedrich Miescher • Realizou o primeiro isolamento de DNA.

5. Histórico ( cont.) • 1928- Griffith Primeira evidencia que o material genético estava constituído por ácidos nucléicos expt. de transformação realizados por com Streptococus Pneumococus • “principio de transformação”.

6. 1944- Avery e cols. • “Baseado nas propriedades físico-químicas a substância indutora parece ser uma forma de • DNA altamente polimerizada e viscosa”. • Polissacarídeo capsular do tipo III, cuja síntese é promovida pelo “principio transformante” • consiste de um polissacarídeo não nitrogenado (material genético vs. produtos de expressão)

7. 1947-Erwin Chargaff 1952- Hershey e Chase Se nos estamos certos, e ele estava, “Os ácidos nucléicos não são estruturalmente importantes, apenas mas se uma substância funcionalmente ativa na determinação das atividades bioquímicas e características específicas da célula, o que permitirá conhecendo esta substância induzir mudanças previsíveis e herdáveis na célula “.

8. 1952 Rosalind Franklin Difração de raios X, mostrou um padrão de periodicidade e largura uniforme do DNA • 1953 – Watson e Crick • -Difração de raios X mostrou que o DNA possui uma forma de hélice regular, fazendo uma • volta completa cada 34 Å, com um diâmetro de aprox. 20 Å e desde que a distância entre • dois nucleotídeos adjacentes é de 3.4 Å a cada volta deve de existir 10 nt. • - A densidade do DNA indica que a dupla hélice contem duas cadeias polipeptídicas e • o diâmetro constante da hélice pode ser mantido se o pareamento é realizado sempre entre • uma purina e uma pirimidina. • - A proporção de G e sempre igual a de C e a de A a de T. por tal motivo a composição • de qualquer DNA pode ser dada pela % de G+C a que varia entre 26-74 % entre diferentes espécies.

9. 1953 – Watson e Crick • Propuseram a estrutura do DNA como dupla hélice. • A estrutura proposta a partir de estudos de cristalografia de raios-X realizados por Franklin. • Ganharam o prêmio Nobel de fisiologia em 1962.

10. Os componentes do DNA

11. Ácidos nucléicos 5´ 5´ HOH2C HOH2C O O OH OH 1´ 1´ 4´ 4´ H H H H H H H H 3´ 2´ 3´ 2´ H OH OH OH Deoxiribose Ribose Polímeros lineares de nucleotídeos unidos por ligações fosfodiester DNA vs. RNA Pentoses

12. H H H N N N H N N H O Guanina H H N H Bases nitrogenadas H H N N H N Purinas N N H H Adenina H H O O N H H H3C H Pirimidinas N N N O H O H O N N H H Citosina Timina Uracila

14. Nucleotídeos H H N N   H  N -O O O O P P P O O O N Adenina NH2 CH2 O O- O- O- H H H H Fosfato H OH Deoxiribose

15. Os nucleotídeos podem agir como transportadores de energia de curta vida, o principal e o ATP

16. O O O -O O O O P P P CH2 O O O O Fosfato H H H H H OH Deoxiribose Adenina Base nitrogenada

17. O O O -O O O O P P P CH2 O O O O Fosfato H H H H H OH Deoxiribose 1’ Guanina Base nitrogenada

18. O O O -O O O O P P P CH2 O O O O Fosfato H H H H H OH Deoxiribose 1’ Timina Base nitrogenada

19. O O O -O O O O P P P CH2 O O O O Fosfato H H H H H OH Deoxiribose 1’ Citosina Base nitrogenada

20. Pareamento de Bases A = T G  C • Bases são complementares. • Pontes de hidrogênio são formadas entre as bases: A = T  2 pontes de hidrogênio G  C  3 pontes de hidrogênio G  C É MAIS ESTÁVEL

21. Pareamento de nucleotídeos H H N N H H O N OH Guanina H CH2 N N O O N Pontes de hidrogênio N H N H H O H2C Citosina OH

22. Pareamento de nucleotídeos OH H N N CH2 O H O N N H3C H H N Adenina N H O H N O H2C Timina OH Pontes de hidrogênio

23. OH Pareamento de fitas de DNA 3´ 5´ H2C O O O O O O O P P P P P P O O O O O O O O O O O O O O O O O O H2C H2C H2C H2C O O O O 5´ H2C O 3´ OH Invertido e Complementar

24. Bases nitrogenadas Grupo fosfato P Molécula de DNA Citosina Pentose Guanina Timina Adenina

25. Volta completa cada 34 Å, com um diâmetro de aprox. 20 Å e desde que a distância entre dois nucleotídeos adjacentes é de 3.4 Å a cada volta deve de existir 10 nt. • A proporção de G e sempre igual a de C e a de A a de T. • A especificidade no pareamento das bases é crucial, o movimento dos átomos de hidrogênio permitem que cada base exista de forma tautomerica, onde os grupos amino (NH2) e cetos (C=O) estão opostos aos grupos iminos (NH) e henol (COH) -

26. * Este modelo requer que as cadeias corram em direções opostas “antiparalelas”, onde os açúcares e grupos fosfatos encontram-se voltados para fora conferindo carga negativa ao DNA.

27. O DNA se replica em forma semiconservativa • Principal requerimento: a informação se deve reproduzir exatamente 1958 - Meselsom-Stahl “Reprodução é semiconservativa”

28. Os pares de bases estão perpendiculares à coluna açúcar-fosfato e contribuem à estabilidade termodinâmica da dupla hélice de duas formas: a- pela união de pontes de hidrogênio ( interações “ Watson-Crick” ou “canônicas” ) b- pelo pareamento hidrofóbico das bases ( interações “stacking” ou “ empilhamento”). Interações eletrostáticas: fosfatos que desestabilizam interações inter-intracadeias e que são neutralizadas pelos íons Na+

29. O DNA dupla hélice tem estruturas alternativas As diferentes estruturas da dupla hélice é determinada pelos seguintes parâmetros: N =número de nt. por volta. H =distância entre unidades repetidas. A variação nestes parâmetros leva a mudanças no grão de rotação. Assim na forma B, cada par de base gira 36 graus em volta do eixo, portanto cada 10bp acontece um giro completo, com uma região estreita de 12 Å “sulco menor” e uma ampla de 22 Å “sulco maior” e a torção das duas fitas entre si formam uma dupla hélice. açúcar e a base do mesmo lado da ligação glicosidica híbridos RNA-DNA

31. Moléculas com tamanhos e seqüências idênticas, mas  na sua topologia se chamam de topoisomeros

33. O DNA pode ser desnaturado e renaturaado • O processo de separação das fitas de DNA (desnaturação) acontece sob condições fisiológicas onde a • especificidade do processo é dada pela complementariedade das bases. • Aumento de temperatura, • Titulação com Ácidos (protonizam os aneis nitrogenados A,C e G) • “ “ Alcalis (deprotonizam os anéis de G e T) • Agentes denaturantes ex. formamida e DMSO. • Geram grupos carregados no interior da dupla hélice, mudanças nas propriedades físico- químicas • ex. densidade Efeito hipocrômico: dimnuição da A260nm ,interação entre as bases (DNA dupla hélice). A260nm (dsDNA)< A260nm (nt livres) Efeito hipercrômico: aumento da A260nm ,desnaturação da duupla hélice. A260nm (dsDNA) ~ A260nm (nt livres)

34. Temperaturade denaturação (Tm):temperatura na qual os 50% do DNA se encontra denaturado se chama de Tm • * Tm depende da composição das bases G-C incrementando 0.4º por 1% incremento de G-C • Ex. DNA com um 40% de G-C Tm=87 ºC • Incremento de 16,6 ºC por cada 10 x na conc. de cátion monovalente. • sob condições fisiológicas a dupla hélice é muito estavel pelo que a desnaturação requer • a participação de enzimas específicas helicases e proteínas estabilizadoras as SSBs. • * Em presença de agentes como formamida Tm se reduz para 40º ( desestabiliza as pontes H) Tm (Cº) = 69,3 + 0.41(GC%).

35. A denaturação é reversível sob condições apropriadas, renaturação, dois passos: • Se encontram regiões complementares; • Pareamento se estende a toda a região “zipper”, • restaurando-se as propriedades perdidas • Hibridização • hibridização líqüida; • em filtros,

36. Classes of Nucleic Acids • DNA - one type, one purpose • RNA - 3 (or 4) types, 3 (or 4) purposes • ribosomal RNA - the basis of structure and function of ribosomes • messenger RNA - carries themessage • transfer RNA - carries the amino acids

37. Principais tipos de RNA rRNA mRNA 5’ 3’ Aminoácido tRNA 3´ 5´ Anticódon

39. RNA synthesis

40. Transcription units • The region of DNA which is transcribed into RNA by RNA Polymerase • From Promoter at the 5’ end • To the Terminator at the 3’ end