Mapiranje hromozoma eukariota

1. Mapiranjehromozomaeukariota

2. Mapiranje hromozoma haploida Analiza tetrada

3. Mapiranje hromozoma haplotida – Analiza tetrada • Posebna tehnika mapiranja kod haploidnih eukariotskih organizama, gljive i jednoćelijske alge. • Sva četiri produkta mejoze daju spore i predstavljau tetradu. • Produkti pojedinačnih mejoza, tetrade se nalaze na jednom mestu (askus). • Uređene i neuređene tetrade.

4. Formiranje tetrada ili oktada • Analizirajući fenotip tetrada direktno se utvrđuje genotip svakog člana tetrade. • Jedan hromozomski set, fenotip je direktan odraz genotipa. • Nema dominanse.

5. ako je PD >NPD, lokusi su vezani ako je PD =NPD onda su na različitim hromozomima. Analiza tetrada – neuređene tetrade, dva gena • Svaki produkt je jedna haploidna jedinka • PD – parentalni tip tetrade • NPD- sadrži dva rekombinovana tipa • T-tetratip – dva parentalna i dva rekombinantna tipa • T i NPD sadrže rekombinante. NPD samo rekombinante, T polovinu rekombinantnih spora. • RF=(1/2T+NPD)/(NPD+PD+T)*100%

6. Analiza uređenih tetrada – mapiranje centromere • Neurospora crasa – lokus za tip parenja. Produkti mejoze su različiti u zavisnosti od toga da li se c.o. odigrao između heterozigotnog lokusa i centromere. Diploidna heterozigotna mejocita. • Ako nema c.o. između centromere i lokusa aleli A i a segregiraju u odvojena jedra posle I mejotičke deobe – Segregacija M’ tipa • A na jednoj, a na drugoj strani

7. Analiza uređenih tetrada – mapiranje centromere • Ako ima c.o. između centromere i lokusa aleli A i a segregiraju u odvojena jedra tek posle II mejotičke deobe – Segregacija M’’. • Promena redosleda A i a spora. • Zavisno kako se centromere prikače na deobno vreteno razlikovaće se raspored spora u linearnom askusu.

8. Analiza uređenih tetrada – mapiranje centromere • Posmatra se veliki broj askusa iz kontrolnih ukrštanja. • RF=½M’’/(M’+M’’) • ½ jer u askusima kod kojih ima rekombinacija dve od 4 hromatide su razmenile DNK. • Ako je distanca 50mu, svi askusi pokazuju M’’ tip segregacije.

9. Mapiranje genoma čoveka

10. Mapiranje genoma čoveka • Nisu moguća test ukrštanja. • Moguća je analiza rodoslova. • Rekombinacione učestalosti između marker lokusa, i marker lokusa i gena sa poznatim fenotipskim efektom. • Razvojem molekularnih tehnika, analiza haploidnih produkata mejoze. • Somatska ćelijska hibridizacija.

11. Mapiranje genoma čoveka • X hromozom je prvi mapirani hromozom samo na osnovu rekombinacionih analiza. • Dovoljno je analizirati muško potomstvo od heterozigotne ženke. • Muškarac sa X-vezanim recesivnim poremećajem za metabolizam šećera (g) i slepilom za boje (c) daje potomke sa ženom bez ovih mutacija (CG/CG). • Ćerke su sve heterozigoti, sa dvostruko spregnutim CG/cg. • Muško potomskvo ovih ćerki može dati uvid u RF-javljaju se parentalni i rekombinovani fenotipovi.

12. Mapiranje genoma čoveka • Da bi se uočili rekombinanti u potomstvu potrebne su informative mejoze. • Veliki rodoslovi i potomstvo kod koga možemo prepoznati rekombinaciju. • NEINFORMATIVNA MEJOZA„ i rekombinantni i nerekombinantni gameti su isti • A1 B1A1 B1 ili • A2 B1A2 B1 • "INFORMATIVNA MEJOZA„ A1 B2 A1 B1rekombinantni gameti su:A2 B1 A2 B2nerekombinanti gameti su:A1 B1 A2 B2

13. Mapiranje genoma čoveka • Koriste se sekvence DNK koje se razlikuju među jedinkama. RFLP, VNTR... • Da bi se uočila rekombinacija koriste se dva markera u heterozigotnom stanju. • Ako je neko heterozigotno restrikcono mesto vezano za neki gen D u heterozigotnom stanju, c.o. između daće rekombinantno potomstvo kao D-3 i d-1-2. • RF je moguće izračunati između različitih marker lokusa i između marker lokusa i gena sa poznatim fenotipskim efetkom.

14. Mapiranje genoma čoveka • Muškarac je heterozigot za neko oboljenje Dd i za molekularni marker M1M2, žena je homozigot za oba. • Pedigre daje genotipove dece u odnosu na gamete koji dolaze od oca. • Dvoje su rekombinanti, RF=33%

15. Mapiranje genom čoveka • Mali broj potomaka u rodoslovima – postoji mogućnost greške uzorka. • “LOD skor” izražava vezanost markera i gena poredeći verovatnoću da će određeni rezultati da se dobiju u slučaju da su dva lokusa vezana i u slučaju da nisu. • LOD skor je log10 odnosa te dve verovatnoće. • LOD skor ≥+3 ukazuje da sulokusi blisko vezani. 1000 x verovatnije da su vezani (log101000=3). • Tačnost metoda je ograničena dostupnošću rodoslova. • Istorijski aspekt. Značaj u konstrukciji preliminarnih mapa.

16. Haploitp x x x x x • Haplotip je set DNK sekvenci (SNP alela) duž regionahromozoma • koji se nasleđujuzajedno u haploidnom gametu • rekombinacija u mejozi kod 1 roditelja • izmedju 2 mesta daje rekombinantni haplotip • 5 različitih haplotipova • 4 segregirajuća mesta x x x x x

18. pregled • Geni na istom hromozomu su vezani i nasleđuju se zajedno. • Ukrštanja koja uključuju vezane gene daju više zastupljenu parentalnu i manje zastupljenu rekombinantnu klasu, usled krosing - overa, tj. mejotičke intrahromozomske rekombinacije. • Krosing-over je recipročna razmena delova homologih hromozoma između nesestrinskih hromatida za vreme profaze I mejoze. • Što su geni udaljeniji na hromozomu, veća je šansa za rekombinaciju, ali i za višestruke krosing-overe. • Mape vezanosti zasnivaju se na odnosu krosing overa i rastojanja među genima i mapirajuće funkcije se koriste da isprave previd učestalosti dobijenih rekombinacija. • Analiza tetrada je tehnika mapiranja gena kod haploidnih eukariota, kod kojih produkti pojedinačne mejoze ostaju zajedno u askusima. • Rastojanje među genima analizom tetrada određuje se relativnom porporcijom tipova tetrada. • Krosing over se može dešavati i u mitozi i tada nastaje mozaični fenotip ili se stvaraju različiti klonovi ćelija • Zaprepoznavanjerekombinanataimapiranjegenau humanomgenomukoriste se rodosloviimolekularnimarkeri, vezanizalokusekojiodredjujunekuosobinu, u heteozigotnomstanju.

19. Vanjedarno nasleđivanje Materinsko nasleđivanje Materinski efekat Infektivno nasleđivanje

20. Materinsko nasleđivanje Nasleđivanje kontrolisano citoplazmatskim faktorima koji se prenose preko jajne ćelije. Fenotip zavisi od gena smeštenih na DNK citoplazmatskih organela.

21. Materinsko nasleđivanje – genomi hloroplasta i mitohondrija • Eukariotske ćelije poseduju organele koje imaju važnu ulogu u metabolizmu. • Mitohondrije pretvaraju organske molekule u energiju, aerobnim, oksidativnim metabolizmom. • Hloroplasti koriste energiju sunčeve svetlosti u cilju sinteze organske materije iz H2O i CO2 . • Poreklo mitohondrija i hloroplasta od prokariota koji su osnovali endosimbionstski odnos sa domaćinom. • Mitohondrije i hloroplasti poseduju sopstvene genome. • Organele koriste neke proteine kodirane nukleusnim genomom kako bi upotpunile produkte svojih genoma.

22. Genom mitohondrija/mtDNK • Većinom cirkularni molekul (postoje izuzeci kod nekih algi i trepljara gde su linearni). • Broj mtDNK po ćeliji je velik i proističe iz velikog broja mitohondrija u ćelijama, kao i više kopija mtDNK unutar pojedinačnih mitohondrija. • Veličina mtDNK je varijabilna kod različitih taksona. • Kod životinja mtDNK je mali i kompaktan molekul, npr. Mitohondrijalni genom čoveka ima 16 571 bp i ima 37 gena, dva kodiraju rRNK, 22 kodiraju tRNK, i 13 kodiraju polipeptide uključene u proces oksidativne fosforilacije. Postoji i kontrolni, nekodirajući region, zajednički za transkripciju i translaciju. • Slična je organizacija mtDNK svih vertebrata, dok je mtDNK invertebrata slične dužine, ali različite organizacije (npr. različit redosled gena). • Genom gljiva je znatno veći. Kvasac ima 78kb mtDNK. • Biljke, pogotovo vaskularne imaju najveće mtDNK genome sa velikom varijabilnošću strukture gena (Marchancia polymorpha 186kb, 570kb kod kukuruza). Sadrže nekodirajuće sevence, duplikacije... • Genetička šifra je malo drugačija kod mtDNK, izrođenost koda je veća, transkripcija i translacija su specifične i međusobno povezane.

23. Genom mitohondrija/mtDNK

24. Genom hloroplastne DNK/cpDNK • Cirkularan je molekul. • Broj cpDNK u ćeliji zavisi od broja hloroplasta i broja DNK po hloroplastu. • Veličina varira među vrstama 85-295kb kod vaskularnih biljaka. • Sadrži oko 110 gena od kojih 50 daju produkte fotosinteze. • Osnovni set podrazumeva gene za rRNK, tRNK, neke ribozomalne proteine, komponente fotosistema, katalitička subjedinica ribuloze 1,5-bisfosfat karboksilaze, i četiri subjedinice RNK polimeraze specifične za hloroplaste. • Imaju ponavljajuće sekvence i duplicirane gene, a rekombiancija između dupliciranih regiona daje veću varijabilnost.

25. Genom hloroplastne DNK/cpDNK

26. mtDNK, cpDNK i nuDNK produkti • Produkti mitohondrijalnih gena funkcionišu samo unutar mitohondrija. Međutim, produkti brojnih nukleusnih gena se takođe nalaze u mitohondrijama. • rRNA mitohondrijalnih ribozoma je kodirana mtDNK, dok su ribozomalni proteini kodirani nuDNK. • Polipeptidi uključeni u oksidativnu fosforilaciju su mozaične prirode, neke subjedinice su kodirane sa mtDNK, a neke sa nuDNK. • Funkcionisanje hloroplasta takođe zavisi od ekspresije gena sa cpDNK i nuDNK. • Postoji tesna i usklađena kooperacija genoma organela i jedarnog genoma.

27. Materinsko nasleđivanje • Različiti rezultati recipročnih ukrštanja dva tipa Neurospora (normal i poky) • Roditlj koji doprinosi sa većinom citoplazme je označen kao majka. • ad- ad+ su aleli jedarnih gena koji segregiraju mendelovskiočekivano. • Smeđe – citoplazma sa poky determinantama, sivo – “normalna” • Sitna ili normalna veličina kolonija je determinisane genima u citoplazmi

28. Materinsko nasleđivanje • Karakteristika materinskog nasledjivanja je da povratna ukrštanja ženki tokom više generacije, ma koliko generacija trajala, nikada ne daju potomstvo sa muškim ni fenotipom ni genotipom. • Kod Neurospora postoji mutant poky, sporog rasta, sa velikom količinom, ali samo jednog citohroma c. Može se sprovesti ukrštanje tako da je donor većeg dela citoplazme "majka", mada nema prave podele polova. • Ukoliko bi poky tip u ukrštanju bio "majka", svi potomci bi bili poky, a ako bi "majka" bila divlji tip, svi bi bili takvi, bez obzira na "oca". Za sve jedarne gene primećuje se Mendelovska segregacija alela.. • Način nasledjivanja gena na mt i cp nije prema mendelovim pravilima i zavisi od načina nasledjivanja organela i broja kopija organela, odnosno njihovih hromozoma u ćeliji.

29. Heteroplazmija • Homoplazmija – prisustvo jednog tipa mtDNK ili cpDNK. • Heteroplazmija – prisustvo više tipova mtDNK ili cpDNK, više od jednog alela nekog gena. • Heteroplazmija u okviru organele • Heteroplazmija u okviru ćelije između organela • Različita tkiva sa različitim genomima organela

30. Heteroplazmija • Različita tkiva sa različitim genomima organela. • Samo deo organela se prenosi u jajnu ćeliju. • Potomci sa različitim genotipom i fenotipom zavisno od toga koje organele su nasleđene. • Mutacije cpDNK uzrokuju nedostatak hloroplasta. • Mirabilis jalapa • Heteroplazmične biljke su mozaici, imaju varijgaciju, bele i zelene delove. • Potomci mogu biti sva tri fenotipa (zeleni, beli i varijegacija.)

31. Mitohondrijske citopatije – oboljenja kod ljudi i defekti na mtDNK • Ćelije obolelih osoba su mešavina mutantnih i normalih mitohondrija – heteroplazmija. • Broj mutantnih mitohondrija je korelisan sa napretkom oboljenja – efekat sa pragom. • Usled heteroplazmije, citoplazmatske segregacije i efekta sa pragom, kod članova jedne porodice oboljenja vezana za mutacije na mtDNK mogu biti različito izražena, od najslabijih do najjačih simptoma. • Organi koji su najviše pogođeni mutacijama su nervi i mišići, tkiva sa visokim energetskim zahtevima. • Većina delecija na mtDNK je de novo nastala i ne nasleđuje se materinski.

32. Mitohondrijske citopatije – oboljenja kod ljudi i defekti na mtDNK • LHON (Leberova nasledna optička neuropatija) – delimično ili potpuno slepilo usled degeneracije optičkog nerva. Više tačkastih mutacija u genima ND1, ND4 i ND6 mtDNK. • KEARNS-SAYRE sindrom. Uzrok delecije različitih delova mtDNK. • MERRF – mioklonična epilepsija i iskrzana crvena mišićna vlakna. Mitohondrije abnormalnog izgleda. Mutacija u genu za tRNK.

33. Mitohondrije i starenje • Mitohondrijska teorija starenja – ROS koje se generišu oštećuju makromolekule mitohondrija. • Nagomilavanje mutacija u mtDNK tokom starenja (tačkaste mutacije, delecije) koje dopirnose fenotipu starenja. • Najpogođenija tkiva sa visokim energetskim zahtevima: nervno, mišićno, srce, jetra...

34. Primena mtDNK u forenzici • Veliki broj mtDNK po ćeliji omogućava korišćenje u situacijama kada su biološki ostaci degradirani i nemoguće je raditi sa STR. • Hipervarijabilni region mtDNK • Iako postoji veliki broj haplotipova, nije jedinstveni identifikator zbog načina maternalnog nasleđivanja. Za isključivanje potencijalnog krivca.

35. Primena mtDNK u forenzici • Identifikacija vrsta preko cekvenci mtDNK • Najpoznatijislučaj forenzičke primene mtDNK analize živog sveta – identifikacija ilegalno prodavanog mesa sivog kita na japanskom i korejanskom tržištu.

36. mtDNK populacija ljudi • FBI Laboratorija, Armed Forces DNA Identification Laboratory, i druge, saradjivale su na kompilacijibaze podatakamtDNK (SWGDAM (Scientific Working Group on DNA Analysis Methods) Database • SWGDAM Database (August 2002): • sadrži HV1 i HV2 sekvenceKavkazaca, Afrikanaca, Azijata, Nativnih amerikanaca i Hispano grupa • sadrži 4,142 mtDNKsekvencinesrodnih osoba u forenzičkom indeksu • sadrži 6,686 mtDNKsekvenciiz laboratorija gde se testira roditeljstvo, banaka krvi itd. • I to je malo da pruži poptunu sliku o sekvencama mtDNK neke populacije

37. Hipotetičko filogenetsko stablo na osnovu polimorfnosti mtDNK humanih populacija

38. Materinski efekat Osobine su kontrolisane genima majke, ali se ispoljavaju kod potomaka. Nije nasleđivanje preko organela jednog roditelja, već prenošenje genetičke informacije iz jedra ćelija majke preko citoplazme na potomke (citoplazmatski uticaj na prenos jedarnih gena). Fenotip potomstva ne zavisi od genotipa jedinke, već od genotipa majke.

39. Materinski efekat • Pre oplođenja jajne ćelije nutritivne i determinišuće materije se transportuju u jajnu ćeliju iz okolnih ćelija. • Hranljive materije i determinante nastaju ekspresijom gena u ženskom reproduktivnom sistemu u germinativnom ili somatskom tkivu. • Ovi geni učestvuju u formiranju jajne ćelije i embriona odmah nakon oplođenja. Tj. transkribuju se sa genoma majke za vreme oogeneze i njihovi produkti (iRNK ili proteini) se deponuju pre oplođenja, a deluju pre oplođenja i odmah nakon oplođenja. • Citoplazmatske determinante, proteinski molekuli odgovorni za formiranje ose tela, npr. osnovni plan Drosophila. • Fenotip embriona je određen alelima prisutnim kod majke. • Geni materinskog efekta.

40. Geni materinskog efekta • Geni koji su neophodni za formiranje jajne ćelije i embriona, ne moraju imati efekta ženku. • Efekat se uočava u sledećoj generaciji. • Recesivna mutacija dorsal (dl). • Potomstvo ne preživljava samo ako je majka recesvini homozigot dl/dl. • Gen kodira transkripcioni faktor koji se produkuje u oogenezi i transportuje se i čuva u jajnoj ćeliji. Rano u razviću determinisaće formiranje dorzalne i ventralne strane tela. Kada produkt nedostaje formira se embion sa dve dorzalne strane. • Letalnost se ne može sprečiti alelom divljeg tipa poreklom od oca jer ovaj gen ne transkribuje u embrionu, već pre toga u polnoj liniji majke. ♀dl/dl x +/+♂ ♀+/+ x dl/dl♂

41. Materinski efekat – smer uvijanja ljušture puža Limnea peregra ♀ ♀ ♂ ♂ P: DD dd dd DD F1: Dd Dd samooplodnja F2: DD Dd Dd dd DD Dd Dd dd samooplodnja F3: ¾ na desno ¼ na levo ¾ na desno ¼ na levo

42. Materinski efekat • Karakteristika materinskog efekta je odlaganje ekspresije muškog fenotipa i genotipa. • Da bi se odredilo da li je nasleđivanje vanjedarno ili se radi o materinskom efektu potrebna je F3 genaracija. • Test ukrštanje: DD ženski roditelj sa desnim uvijanjem se ukrste sa dd muškim roditeljem sa levim uvijanjem. Potomci će svi biti sa Dd i desnim uvijanjem. Ako se oni ponovo ukrste da dd levo uvijenim muškim roditeljem, u sledećoj generaciji svi će biti uvijeni u desno iako će odnos genotipova bit Dd:dd=1:1. Ako se te jedinke ponovo ukrste kao ženski roditelji sa dd levo uvijenim muškim roditeljima, konačno će se dobiti odnos dva fenotipa 1:1. • Ponovljena povratna ukrštanja će u slučaju da se radi o materinskom efektu dati jedinke muškog genotipa. ♀ ♂ DD dd ♀ ♂ Dd dd ♀ ♂ ♂ Dd dd dd dd dd Dd dd Dd 1 : 1

43. Infektivno nasleđivanje Paraziti koji se nalaze u citoplazmi daju određeni fenotip domaćinu i prenose se na potomstvo.

44. Infektivno nasleđivanje • Nakon anesteziranja sa CO2Drosophila se brzo oporavi. • Pojedni sojevi se ne oporavljaju od anestezije. • Osetljivost na CO2 se prenosi sa majke na potomstvo i uzrokovano je rabdovirusom σ. • Bakterija Wolbachia koja je prisutna u preko 20% vrsta insekata i izaziva niz fenotipskih efekata se prenosi preko citoplazme jajne ćelije na potomstvo.

45. Infektivno nasleđivanje • Neki sojevi kvasca imaju killer fenotip, luče toksin koji ubija druge sojeve. • U citoplazmi imaju dva tipa virusa M i L. Genom M virusa kodira toksin, ali ne može postojati u ćeliji bez L virusa jer ne kodira polimerazu i proteine kapsida. • Osetljivi sojevi ili nemaju ni M ni L ili imaju samo L. • L i M virusi ne izlaze iz ćelije, prenose se u procesu preprodukcije domaćina.