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CENTRO DI RICERCA SULLE TECNOLOGIE FARMACEUTICHE TRADIZIONALI ED INNOVATIVE

Te.Far.T.I. CENTRO DI RICERCA SULLE TECNOLOGIE FARMACEUTICHE TRADIZIONALI ED INNOVATIVE. NANOPARTICELLE PER IL DIREZIONAMENTO CEREBRALE DI FARMACI. G. Tosi * , L. Costantino*, F. Gandolfi*, B. Ruozi*, F. Rivasi**, F. Forni*, M.A. Vandelli*.

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Presentation Transcript

  1. Te.Far.T.I. CENTRO DI RICERCA SULLE TECNOLOGIE FARMACEUTICHE TRADIZIONALI ED INNOVATIVE NANOPARTICELLE PER IL DIREZIONAMENTO CEREBRALE DI FARMACI G. Tosi*, L. Costantino*, F. Gandolfi*, B. Ruozi*, F. Rivasi**, F. Forni*, M.A. Vandelli* * Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Università di Modena e Reggio Emilia,Via Campi 183, 41100 Modena **Dipartimento Integrato Servizi Diagnostici e di Laboratorio e di Medicina Legale, Università di Modena e Reggio Emilia, Via del Pozzo 71, 41100 Modena. tosi.giovanni@unimore.it 45° Simposio AFI 2005

  2. DIREZIONAMENTO DI FARMACI al Sistema Nervoso Centrale • Patologie cerebrali come tumori, demenza da HIV, ischemie • Difficoltà di raggiungere concentrazioni sufficienti nei distretti cerebrali • Barriera Ematoencefalica (BEE) • Superamento della BEE 45° Simposio AFI 2005

  3. Barriera Ematoencefalica • Mancanza di fenestrature nelle cellule endoteliali di vasi • Giunzioni occludenti fra le cellule delle pareti vascolari • Alto numero di tight-junction • Basso numero di vescicole pinocitiche • Processi metabolici alterati 45° Simposio AFI 2005

  4. Passaggio attraverso BEE di sostanze • Diffusione transcellulare; • Diffusione paracellulare; • Trasporto mediato da Carrier; • Endocitosi in fase fluida; • Endocitosi per assorbimento; • Endocitosi mediata da recettore; • Efflusso. 98% dei farmaci utilizzabili in patologie cerebrali non supera la BEE (peso molecolare, polarità) 45° Simposio AFI 2005

  5. Approcci invasivi Rottura temporanea delle tight-junction Infusione intracerebrale, o impianti intracerebrali (Cateteri, microchip, sistemi polimerici) 45° Simposio AFI 2005

  6. Approcci non invasivi • Pro-drug • Coniugazione dei farmaci con un vettore di trasporto quali proteine modificate, anticorpi monoclonali, recettori di barriera • Nanoparticelle e liposomi 45° Simposio AFI 2005

  7. Nanoparticelle • Sistemi polimerici di dimensioni nanometriche di forma sferica • Polimeri biodegradabili e biocompatibili • Non tossici ed immunogenici • Copolimero acido lattico e glicolico (PLGA) 45° Simposio AFI 2005

  8. Modificazioni del polimero • Limitata permeabilità della BEE da parte di Np di PLGA • Modificazioni con molecole “ligando-specifiche” • Internalizzazione mediata da recettore • Peptidi oppioidi • MMP-2200 (H2N-Tyr-D-Thr-Gly-Phe-Leu-Ser-O-b-D-lactose-CONH2)* *R. Polt, M.M. Palian Glycopeptide analgesics, Drugs Fut. 26 (6) (2001) 561-576. 45° Simposio AFI 2005

  9. 45° Simposio AFI 2005 O C NH-Peptide PLGA Modificazione del polimero • Ser-OH • Ser-O-b-D-glucose • Ser-O-b-D-galactose • Ser-O-b-D-xylose • Ser-O-b-D-lactose X • Sintesi di analogo peptidico* (H2N-Gly-Phe-D-Thr-Gly-Phe-Leu-X-CONH2) • Sostituzione della molecole di Tyr con Phe per evitare l’effetto oppioide ** • Coniugazione col polimero (PLGA) tramite legame ammidico • Caratterizzazione tramite NMR 200/400, Spettrometria di Massa * Costantino L., Vandelli M.A., Forni F., Peptidi per la veicolazione di farmaci., Italian Patent n° MI2004A002353, 2004 ** A. F. Casy, R.T. Parfitt, Opioid analgesics. Chemistry and receptors, Plenum, New York, 1986, pp. 342-353.

  10. Approcci di letteratura Superamento BEE • Studi in vivo • Determinazione posizione delle Np • Farmaci radiomarcati (3H) incapsulati in nanoparticelle • Farmaci fluorescenti incapsulati in nanoparticelle (6-cumarina1, fluorescenza verde) • Polimero radiomarcato (14C) 6-cumarina 1Panyam J, et al. Fluorescence and electron microscopy probes for cellular and tissue uptake. Int J Phar 2003;262:1-11 45° Simposio AFI 2005

  11. Sperimentazioni in vitro su colture cellulari • Utilizzo di sostanze radioattive • Valutazione quantitativa della radioattività in omogenati di tessuti (microcircolazione e parenchima) dopo sperimentazioni in vivo • Nessuna informazione sulla POSIZIONE delle nanoparticelle nei tessuti in vivo Limiti 45° Simposio AFI 2005

  12. Fluoresceina • Modificazione del PLGA • Utilizzo della microscopia a fluorescenza Rodamina Np costituite da PLGA modificato con Fluoresceina (F-Np) Np costituite da PLGA modificato con Rodamina (R-Np) 45° Simposio AFI 2005

  13. Preparazione delle Np • Sequenza glicopeptidica, molecola direzionante verso la BEE (P-PLGA) • PLGA modificato con marker fluorescenti F-PLGAR-PLGA • Np costituite da 80% P-PLGA e da 20% F-PLGA o R-PLGA • Np con una molecola ligando-specificaper BEEe conFluoresceina eRodamina come marker per la fluorescenza(F-L-Np) (R-L-Np) Pep Pep Fluor Rodamina NP NP 45° Simposio AFI 2005

  14. Caratterizzazione della superficie delle Np modificate • Electron Spectroscopy for Chemical Analysis(ESCA) per valutare la posizione dei peptidi sulla superificie delle Np Pep Dislocazione del Peptide verso l’esterno della NP Presenza dell’Azoto sulla superficie delle Np Pep Pep Pep Pep NP Pep Pep 45° Simposio AFI 2005 Pep

  15. 45° Simposio AFI 2005 Sperimentazione in vivo • Perfusione cerebrale (In situ brain perfusion technique) • Infusione in vena femorale. • Ratti maschi Wistar Hannover (n° 50), 300 g. Takasato Y, Rapaport SI, Smith QR. An in situ brain perfusion technique to study cerebrovascular transport in the rat. Am J Physiol 1984;247:H484-93.

  16. 45° Simposio AFI 2005 Fluorescenza SUDDIVISIONE DELL’ENCEFALO DEL RATTO • Trattamento degli organi (cervello, fegato, reni, milza): azoto liquido • Cervello suddiviso in tre aree: anteriore, mediana, posteriore • Taglio con criotomo di campioni di 5 mm • DAPI (4'-6-Diamidino-2-fenilindolo)* • Interazione con le catene del DNAe colorazione Blu dei complessi • Microscopio a fluorescenza con filtro FITC, TRITC e DAPI • Trattamento con Ematossilina eosina per struttura morfologica Vaso cerebrale *Xu Z, et al. Modulation of nucleic acid structure by ligand binding: induction of a DNA·RNA·DNA hybrid triplex by DAPI intercalation. Bioorg & Med Chem 1997;5(6):1137-1147. COLORAZIONE CON EMATOSSILINA-EOSINA PER MORFOLOGIA DAPI-Nuclei

  17. PERFUSIONE CEREBRALE

  18. Perfusione cerebraledi Np fluorescenti NON modificate (100% F-PLGA) Nuclei-DAPI F-Np Vaso cerebrale Vaso cerebrale 1 2 • Localizzazione nei vasi cerebrali • Integrità della BEE 45° Simposio AFI 2005

  19. 45° Simposio AFI 2005 Perfusione cerebrale di Np fluorescenti modificate (F-P-Np) Parenchima cerebrale F-P-Np • Adesione alla parete dei vasi • Localizzazione cellulare delle nanoparticelle Vaso cerebrale F-P-Np 1 2 F-P-Np Parenchima cerebrale Parenchima cerebrale F-P-Np 3 4

  20. 45° Simposio AFI 2005 Perfusione cerebraledi Np fluorescenti modificate (R-P-Np) R-P-Np • Np superano BEE in virtù della presenza della modificazione sul polimero Parenchima cerebrale R-P-Np R-P-Np

  21. PERFUSIONE FEMORALE

  22. Perfusione femorale di F-P-Np e R-P-Np Tempo: 0-30 minuti • Uptake epatico F-P-Np R-P-Np Parenchima epatociti 45° Simposio AFI 2005

  23. Perfusione femoraledi Np fluorescenti modificate (R-P-Np) Tempo 60-120 minuti R-P-Np Parenchima epatico Parenchima splenico 45° Simposio AFI 2005

  24. Perfusione femoraledi Np fluorescenti modificate (R-P-Np) Tempo 60-120 minuti R-P-Np Parenchima cerebrale • By pass del uptake epatico • Selettività verso BEE • Superamento della BEE 45° Simposio AFI 2005

  25. 45° Simposio AFI 2005 Studi al microscopio confocale • Singolo piano nello spessore del campione • Np e Cellule Cerebrali sono co-localizzate e in stretto contatto F-P-Np R-P-Np

  26. Microscopio confocale: Ricostruzione Tridimensionale Np e parenchima cerebrale F-P-Np R-P-Np 45° Simposio AFI 2005

  27. Conclusioni • Sintesi di un nuovo eptapeptide simil-oppioide come molecola ligando specifica per il superamento della barriera ematoencefalica • Coniugazione PLGA con peptide e marker fluorescenti (Fluoresceina e Rodamina) • Test in vivo di perfusione cerebrale e femorale • Studi di microscopia a fluorescenza e confocale 45° Simposio AFI 2005

  28. Conclusioni • Perfusione Cerebrale • Internalizzazione delle Np modificate col ligando specifico (F-P-Np e R-P-Np) • Evidenza di una extravasazione delle Np modificate rispetto alle analoghe non modificate la cui localizzazione è limitata ai vasi • Ipotizzabile passaggio della BEE in conseguenza della modificazione della Np • Perfusione Femorale • Np modificate bypassano uptake epatico per localizzarsi a livello cerebrale 45° Simposio AFI 2005

  29. Si ringrazia: • Centro Interdipartimentale Grandi Strumenti (CIGS) dell’Università di Modena e Reggio Emilia • Dipartimento integrato Servizi Diagnostici e di Laboratorio e di Medicina Legale, Sezione di Anatomia Patologica, Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia • Fondazione Cassa di Risparmio di Modena e Reggio Emilia 45° Simposio AFI 2005

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