Analisi di proteine:

1. Analisi di proteine: Elettroforesi e Western Blot Seminario Metodologico per il Corso di Didattica Libera Marilena Dinardo mm.dinardo@biologia.uniba.it

2. Le proteine sono il prodotto dei geni: sono le proteine che servono a “fabbricare” un organismo, a farlo funzionare e, quando sono difettose, si rendono responsabili di malattie. • Ed è proprio attraverso lo studio del funzionamento delle proteine che si potrebbe arrivare alla costruzione di nuovi farmaci….

3. Purificazione delle proteine: • La purificazione di una proteina costituisce il primo passaggio nello studio delle sue proprietà. • Una proteina, per poter essere purificata, deve dapprima essere estratta dalla sua matrice biologica e poi allontanata selettivamente dalle altre proteine.

4. La procedura adottata per ottenere un estratto grezzo (estratto contenente tutte le proteine cellulari solubili nel tampone di estrazione utilizzato) dipende dalla localizzazione cellulare della proteina di interesse.

5. La rottura delle cellule può essere ottenuta mediante: • Digestione enzimatica della parete o della membrana plasmatica mediante appropriate miscele di cellulasi, lipasi e proteasi (tripsina, collagenasi, ialuronidasi); • Shock osmotico; • Successivi cicli di congelamento/scongelamento; Generalmente devono però essere applicati metodi più energici, che sottopongono le cellule a stress meccanici. I metodi di rottura meccanici sono fondamentalmente di due tipi: • mediante forze frizionali tra cellule e materiale solido; • mediante forze frizionali in sospensione di cellule.

6. Gli omogeneizzatori sono costituiti da un tubo di vetro e da un pestello mosso a mano (Dounce o Tenbrock) o elettronicamente (Potter-Elvejham). Il tubo è mantenuto fisso mentre il pestello viene fatto ruotare per generare le forze frizionali, le quali sono più elevate alla superficie del pestello e minime lungo la parete del tubo. Lo spazio libero tra il pestello e la parete del tubo è mantenuta entro dimensioni precise in quanto l’attrito sviluppato dipende dal raggio del pestello e del tubo di vetro e dalla velocità di rotazione del pestello stesso.

7. Le procedure utilizzate per ottenere un estratto proteico grezzo sono estremamente semplici e richiedono: • - la rottura delle cellule in uno specifico buffer; • - la centrifugazione del campione per rimuovere i residui insolubili.

8. Campioni proteici • Estratti di tessuti o cellule • Proteine ricombinanti “etichettate” con antigeni (“tags”: HA, T7) • Virus interi purificati • Localizzazione cellulare (nucleo, membrana, citoplasma)

9. Estrazione delle proteine Lisi delle cellule con un tampone di lisi che dissocia le proteine e inibisce le proteasi cellulari • Concentrazione dei sali • Detergenti (Triton X-100, NP40, SDS) • pH • Inibitori di proteasi • Bassa temperatura (ghiaccio) Proteasi Proteasi Inibitori proteasi: Leupeptina, Pepstatina, Aprotinina, PMSF

10. Elettroforesi

11. Analisi elettroforetica delle proteine del siero

12. La velocità di una molecola carica che si muove in un campo elettrico è direttamente proporzionale alla forza del campo elettrico (E) e alla carica della molecola (q) ed è inversamente proporzionale alle dimensioni della molecola e alla viscosità del mezzo in cui si muove (forze frizionali fo resistenza): v = Eq/f dove f=6πrη Elettroforesi

13. Fattori che influenzano la velocità di migrazione • CAMPIONE (Carica, Dimensioni, Forma) • TAMPONE (Concentrazione, pH) • SUPPORTO (Adsorbimento, Filtrazione molecolare)

14. SUPPORTI • Non setaccianti • (Carta), acetato di cellulosa • Setaccianti • Gel di poliacrilammide(PAG) • Gel di Agarosio

15. Elettroforesi su gel Metodo per separare le molecole (DNA, RNA, proteine, etc.) sulla base di proprieta’ fisiche o chimiche quali: (1) dimensioni (2) forma (3) carica elettrica

16. Elettroforesi di DNA • I gel sono fatti di agarosio o di poliacrilammide • I campioni di DNA vengono caricati ed e’ applicata una differenza di potenziale • Il DNA, carico negativamente, migra verso l’elettrodo “+” • I frammenti di DNA piu’ piccoli migrano piu’ velocemente

17. Elettroforesi di Proteine • Piu’ complessa dell’elettroforesi di DNA • Proteine diverse hanno cariche diverse • Le proteine variano molto per forma • Generalmente il gel e’ fatto di poliacrilammide

18. Perche’ usare Gel di Poliacrilammide per separare le proteine? • I gel di poliacrilammide hanno una trama piu’ compatta • I pori hanno dimensioni minori che nei gel di agarosio • Le proteine sono molto piu’ piccole del DNA • Amminoacido medio = 110 Da • Paio di nucleotidi medio = 649 Da • 1 kilobase di DNA = 650 kDa • 1 kilobase di DNA codifica 333 amminoacidi = 36 kDa

19. Elettroforesi di proteineCondizioni Non Denaturanti • Non-denaturante (nativo): nessun pre-trattamento delle proteine prima dell’elettroforesi • Le proteine conservano la loro forma normale (struttura 2° e 3°; legami disolfuro covalenti) • Le proteine conservano la loro carica normale • Le proteine sono separate sulla base di carica, dimensioni e forma +3 30kD 4 42kD

20. Elettroforesi di proteine Condizioni denaturanti • Le proteine sono trattate con SDS (detergente anionico) prima dell’ elettroforesi (SDS-PAGE) • Le molecole di SDS si legano alle proteine • Le proteine perdono la loro normale forma • Le proteine hanno tutte lo stesso rapporto carica/massa • Le proteine vengono separate esclusivamente sulla base delle loro dimensioni CaricaMassa +3 30kD 4 42kD CaricaMassa 300 30kD 420 42kD SDS

22. CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 O S O O SDS - O SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) • SDS (Sodio Dodecil Solfato) • Solubilizza e denatura le proteine • Aggiunge cariche negative alle proteine

23. Proteina Nativa Carica netta: -4 Proteina trattata con SDS Carica netta: Molto (-)

24. Sistemi per la corsa di SDS-PAGE Amersham Biosciences Bio-Rad Piccolo (8 x 10 cm) Medio (16 x 16 cm)

25. SDS-PAGE acrilammide/bis-acrilammide 29:1 (6-20%)+ SDS 0.1% Colorazione con Blu di Coomassie

26. – + Come funziona un Gel SDS-PAGE ? • Le proteine cariche negativamente si muovono verso l’elettrodo positivo • Proteine piu’ piccole si muovono piu’ velocemente • Le proteine si separano per dimensione SDS, calore s-s Proteine con SDS

27. Cosa c’e’ nelbuffer di caricamento? • Un tampone (Tris) per fornire il giusto pH (6,8) • SDS (Sodio Dodecil Solfato) per solubilizzare le proteine e fornire loro una carica negativa complessiva • Glicerolo per rendere pesanti i campioni e farli scendere nei pozzetti • Un agente riducente (DTT o b-Mercaptoetanolo) per rompere i legami disolfuro • Un colorante (Blu di Bromofenolo) per visualizzare i campioni

28. Il Gel • E’ costituito da due parti: • Stacking gel: 4-5% gel superiore, pH 6.8 • Running gel: 8-14% gel separatore, pH 8.8 • Le molecole di acrilammide sono tenute assieme dalla bis-acrilammide, formando una struttura a lattice • Polimerizzazione piu’ rapida aggiungendo catalizzatori: TEMED e APS

29. Il Gel Componenti del gel SDS-PAGE • Soluzione di Acrilammide/Bis-Acrilammide • Tris-HCl pH 6.8 oppure Tris-HCl pH 8.8 • SDS • ddH2O • TEMED • APS (ammonio persolfato) • Buffer di corsa (Tris, Glicina, SDS)

30. Il Gel • Come funziona: • Proteine vengono caricate, viene applicata una corrente elettrica • Includere un marker di peso molecolare colorato • 10-50ug di estratto proteico totale • 0.1-1ug di proteina purificata • Ioni Cloruro (-) / Proteina / Glicina (+) • Si muovono verso il gel separatore (“resolving”) • Differenze di pH causano la ionizzazione della glicina, permettendo alle proteine di migrare nel gel separatore – Stacking pH 6,8 Resolving pH 8,8 +

31. % di acrilammide consigliata 8% 10% 12% Dimensioni delle proteine 40-200 kDa 21-100 kDa 10-40 kDa Il Gel

32. Visualizzazione delle proteine nel gel I due metodi piu’ usati sono: Colorazione con il Coomassie Brilliant Colorazione con l’argento “Silver staining” (puo’ essere visualizzato ~1ng di proteina per banda) Coomassie staining Silver staining

33. kD mm 203 8.5 135 12.0 86 18.5 41 28.0 33 34.0 19 41.5 8 44.5 Stima dei pesi molecolari 250 200 150 Dimensioni in kDa 100 50 0 0 20 40 60 Distanza (mm dal pozzetto)

34. Stima dei pesi molecolari

35. Western Blotting

36. Southern Blot: Per l’analisi del DNA. (sonda = DNA o RNA). Northern Blot: Per l’analisi dell’ RNA. (sonda = DNA o RNA). Western Blot:Per l’analisi delle proteine. (sonda = anticorpo).

37. Cosa e’ un Western Blot? • Una tecnica in cui le proteine sono separate mediante elettroforesi su gel e successivamente trasferite su un supporto (membrana o filtro). Successivamente una specifica proteina viene identificata mediante la sua reazione specifica con un anticorpo.

38. – + A cosa serve il Western Blot? Qual e’ la proteina che mi interessa? • SDS-PAGE (non certo) • Si basa sul confronto di peso molecolare • Western blot (certo) • Si basa su una reazione specifica antigene-anticorpo ?

39. Fasi di un Western Blot • Prima fase: elettroforesi su gel. (Le proteine del campione vengono separate su un gel in base alle loro dimensioni) • Seconda fase: trasferimento su membrana. (Le proteine nel gel sono poi trasferite su una membrana di nitrocellulosa mediante un campo elettrico) • Terza fase: saturazione o “blocking”. (La saturazione e’ usata per prevenire le interazioni non specifiche tra l’anticorpo e la membrana)

40. Fasi di un Western Blot • Quarta fase: legame dell’anticorpo primario. (L’anticorpo riconosce la proteina specifica immobilizzata sulla membrana) • Quinta fase: legame dell’anticorpo secondario. (L’anticorpo secondario, coniugato a un enzima (AP o HRP), riconosce specificamente l’anticorpo primario, gia’ legato alla proteina sulla membrana) • Sesta fase: rivelazione o “detection”. (L’enzima coniugato all’anticorpo secondario scinde un substrato che, in corrispondenza della proteina specifica, sviluppa precipitato colorato o chemioluminescenza)

41. Western blot: seconda faseImmobilizzazione e trasferimento Le proteine nel gel sono ancora in soluzione • Le bande diffondono e si confondono col tempo E’ necessaria l’immobilizzazione per: • Preservare in maniera permanente l’esperimento di elettroforesi • Permettere il riconoscimento di proteine specifiche La strategia piu’ comune e’ il trasferimento su membrana • Nitrocellulosa • PVDF (Polivinilidene fluoride) • Nylon

42. Western blot: seconda faseImmobilizzazione e trasferimento membrana

43. Western blot: seconda faseImmobilizzazione e trasferimento • Elettroblotting • Apparato di trasferimento • Il gel e’ messo tra strati di carta da filtro con la membrana a diretto contatto col gel sul lato verso l’elettrodo positivo • Viene applicato un campo elettrico e le proteine migrano fuori dal gel verso l’elettrodo positivo e si legano alla membrana • Fatto a 4°C per evitare surriscaldamento, decomposizione del tampone e degradazione delle proteine

44. Western blot: seconda faseImmobilizzazione e trasferimento Trasferimento dal catodo (-) all’ anodo (+) • Spugnette • 3 fogli di carta da filtro imbevuti di tampone di trasferimento • Gel • Membrana • 3 fogli di carta da filtro imbevuti di tampone di trasferimento • Spugnette

45. Apparato per il trasferimento “Semi-dry”

46. Western Blotting + - Buffer-soaked filter papers Nitrocellulose membrane Gel Buffer Electrode SDS-PAGE Direction of transfer Wet blotting Assemble ‘sandwich’ Graphite Electrode Plates - Stained (Red Ponceau) + Semi-dry blotting Nitrocellulose with bound proteins

47. Western blot: seconda faseImmobilizzazione e trasferimento • Componenti del tampone di trasferimento: • 25mM Tris • 190mM glicina • 20% metanolo

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49. Western blot: terza fasesaturazione o “blocking” • Per saturare i siti idrofobici liberi sulla membrana • Per prevenire il legame dell’anticorpo primario alla membrana stessa • Latte scremato o Albumina di Siero Bovino (BSA)

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