Analiza specjacyjna platyny w próbkach roślinnych Jakub Ignatowski

1. Analiza specjacyjna platyny w próbkach roślinnych Jakub Ignatowski Pracownia Chemii Analitycznej Stosowanej Kierujący pracą: dr Joanna Kowalska Opiekun: dr Monika Asztemborska WSTĘP Z uwagi na szerokie zastosowanie platyny obserwuje się wzrost zawartości tego pierwiastka w środowisku naturalnym. Dlatego też podejmuje się badania mające na celu poznanie jej cykli biogeochemicznych, określenie możliwości zatężania platyny w różnych ogniwach łańcucha pokarmowego oraz identyfikację związków, w jakich występuje ona w organizmach. Mimo niewielkiej biodostępności, platyna pobierana jest przez rośliny. Wysokie współczynniki zatężania platyny zaobserwowano dla roślin uprawianych hydroponicznie na pożywkach wzbogaconych solą tego metalu. Przy podwyższonej zawartości metali ciężkich, takich jak Cd, Zn lub Pb w podłożu, w komórkach roślinnych dochodzi do syntezy fitochelatyn (PCn). Są to związki organiczne, składające się z dwóch do jedenastu grup -glutamylocysteinowych oraz zamykającej cząsteczkę glicyny (-Glu-Cys)nGly. OPTYMALIZACJA WARUNKÓW ROZDZIELANIA Przed przystąpieniem do analizy związków tiolowych w ekstraktach badanych roślin zoptymalizowano warunki rozdzielania chromatograficznego w odwróconym układzie faz, stosując jako modelowe związki tiolowe cysteinę (Cys), glutation zredukowany (GSH), glutation utleniony (GSSG) oraz ditiotreitol (DTT). PORÓWNANIE MOŻLIWOŚCI OZNACZANIA ZWIĄZKÓW TIOLOWYCH METODAMI RP-HPLC-PAD i RP-HPLC-UV Sprawdzono możliwość zastosowania amperometrii pulsowej i spektrofotometrii jako metod detekcji w wysokosprawnej chromatografii cieczowej do analizy związków tiolowych. Detekcja UV :  = 220 nm Detekcja elektrochemiczna: Edet = 1,4 V; tdet = 240 ms (tdel = 140 ms) Eoxd = 1,6 V; toxd = 180 ms; Ered = -0,8 V; tred = 500 ms. Elektrody: Au (pracująca), Ag/AgCl/KCl (odniesienia) i Pt (pomocnicza). ACN : woda (1:99) detekcja spektrofotometryczna detekcja elektrochemiczna GSSG ACN : 0,05% TFA (1:99) Cys Cys GSH GSH GSSG DTT PC2 DTT PC2 Związki te syntetyzowane są w komórkach roślin z glutationu w wyniku reakcji enzymatycznej. Ich rolą jest kompleksowanie jonów metali i transport do wakuoli.. W przypadku platyny mechanizm ten jest w literaturze jedynie postulowany i jak sugerują autorzy nielicznych publikacji na ten temat wymaga weryfikacji. Chromatogramy mieszanin związków tiolowych ( stężenia tioli: 0,05; 0,5; 2,5 mmol/L) 0,05% TFA detekcja elektrochemiczna detekcja spektrofotometryczna CEL PRACY Celem podjętych w ramach pracy badań było potwierdzenie syntezy fitochelatyn w roślinach narażonych na stres, wywołany podwyższoną zawartością platyny w podłożu. Do badań wykorzystano wysokosprawną chromatografię cieczową z detekcją spektrofotometryczną (HPLC –UV) i elektrochemiczną (HPLC –PAD). ACN : bufor fosforanowy (0,2mol/L; pH 4,6) (2:98) PRZYGOTOWANIE ROŚLIN Wykorzystaną do badań gorczycę białą (Sinapis alba L.) uprawiano hydroponicznie przez okres trzech tygodni na pożywce zawierającej azotan tetraaminaplatyny (II) - stężenie metalu w pożywce wynosiło 500μg/L. ACN : bufor fosforanowy (0,2mol/L; pH 3) (2:98) Zależności powierzchni pików od stężenia poszczególnych związków tiolowych otrzymane metodami: HPLC – PAD oraz HPLC - UV. Chromatogramy mieszaniny związków tiolowych otrzymane przy zastosowaniu różnych faz ruchomych (kolumna: ZORBAX Eclipse XDB-C18 4,6x250mm, przepływ 1ml/min, objętość próbki 20 uL , detektor UV : 220 nm). W dalszej pracy jako fazę ruchomą stosowano: ACN : 0,05% TFA (1:99) • PODSUMOWANIE • Zastosowana metoda chromatograficzna umożliwia rozdzielenie analizowanych związków tiolowych; • Zarówno amperometria pulsowa jak i spektrofotometria przy długości fali 220 nm umożliwiają detekcję badanych tioli; • Spektrofotometria, jako stosowana metoda detekcji, charakteryzuje się niższą granicą wykrywalności (0,01mmol/L) w porównaniu z amperometrią pulsową na elektrodzie złotej (0,5 mmol/L); • Opracowane metody zostaną zastosowane do analizy związków tiolowych w ekstraktach gorczycy białej, uprawianej hydroponicznie z dodatkiem soli platyny (II). Po zakończeniu uprawy prowadzono ekstrakcję platyny ze świeżego materiału roślinnego. Około 2 g próbki - świeżo ściętych liści, łodyg lub korzeni zamrażano w ciekłym azocie, rozdrabniano i ujednorodniano. Następnie dodawano ekstrahenta (30 mmol/L TRIS – HCl, pH 8) i wytrząsano przez jedną godzinę). Otrzymane ekstrakty odwirowywano 30 min z prędkością 3000 obr/min i liofilizowano.