Dojrzewanie oocytów kręgowców wstrzymane jest w metafazie II podziału mejotycznego.

1. Wpływ niespecyficznego inhibitora kinaz białkowych 6-dimetyloaminopuryny na aktywacje oocytów myszy.

2. Dojrzewanie oocytów kręgowców wstrzymane jest w metafazie II podziału mejotycznego. • Możliwe jest ono dzięki działaniu CSF , który stabilizuje aktywność MPF. • Po wniknięciu do oocytu plemnika dochodzi do inaktywacji CSF i MPF, co powoduje aktywacje oocytu- opuszczenie stadium metafazy II , ukończenie mejozy z odcięciem drugiego ciałka kierunkowego oraz dekondensacje chromatyny oocytu i plemnika , z których powstaje przedjądrze męskie i żeńskie . • Inaktywacja MPF powoduje przejście do inerfazy.

3. 6-DMAP powoduje formowanie jądra oraz inaktywacje CSF i MPF w oocytach zatrzymanych w metafazie II u Patella i Xenopus. • U myszy 6-DMAP indukuje dekondensacje chromosomów w każdym stadium mejotycznego cyklu komórkowego – od prometafazy I do telofazy I – jednak nie powoduje tego w metafazie II.

4. Praca ta ma na celu wyjaśnienie efektów jakie wywołuje 6-DMAP w oocytach w stadium metafazy jak i w oocytach zaktywowanych. • Owulowane oocyty traktowane były 6-DMAP oraz 6-DMAP w połączeniu z czynnikami partenogentycznymi : przenośnikiem jonów wapniowych-A23187, inhibitorem syntez białkowych –cykloheksymidem i estrem forbolu -PMA. • Traktowanie oocytów A23187 powoduje odcięcie drugiego ciałka kierunkowego, ale oocty zatrzymane sa w metafazie III. • 6-DMAP zapobiega zatrzymaniu w metafazie III- oocyty wchodzą w interfaze . W połączeniu z czynnikiem partenogentycznym przyspiesza wejście w interfaze .

5. Materiały i metody • Oocyty otoczone komórkami pęcherzykowymi wyizolowano z jajowodów 9-12 tygodniowych samic myszy CD-1 , którym wstrzyknięto dootrzewnowo 5 I.U. serogonadotropiny źrebnej klaczy (PMSG) oraz ludzką gonadotropinę kosmówkową (HCG)- 61 -65 lub 13-17 godzin przed wyizolowaniem. • Oocyty inkubowane były w pożywce MEM z hialuronidazą a następnie w MEM. • Kontrolne oocyty poddane zostały działaniu MEM zawierającej takie stężenie DMSO jakie jest w roztworach czynników partenogenetycznych. • Zapłodnienie in-vitro przeprowadzono w MEM .

6. Rezultaty 6-DMAP + A23187 Oocyty 13 h po iniekcji HCG traktowane były A23187 , 6-DMAP lub A23187 + 6-DMAP Oocyty zapłodnione , uzyskane 17h po iniekcji HCG , potraktowane A23187 użyto jako pozytywnej kontroli. Oocyty kontrolowane były co godzinę od momentu poddania ich działaniu czynników.

7. Tabela przedstawia jaki procent oocytów poddanych działaniu określonych czynników utworzył jądro w określonym czasie.

8. * Mniej niż 25% oocytów uzyskanych po 13h po potraktowaniu HCG oraz poddanych działaniu A23187 utworzyło jądro , chociaż drugie ciałko kierunkowe pojawiło się u ponad 90% badanych oocytów. W większości przypadków zaobserwowano rozproszone chromosomy. * 80% oocytów potraktowanyvh A23187 oraz 6-DMAP uformowało jądro w przeciągu 1h a 100% uformowało jądro w przeciągu 2h.

9. A: Kontrolne oocyty w metafazie II • B:6-DMAP • C:Zapłodnione oocyty –utworzone przedjądrze odcięte drugie ciałko kierunkowe • D:A23187 17h obecne przedjądrze • E:A23187 13h odcięte drugie ciałko kierynkowe, zatrzymane w metafazie III • F:A23187+6-DMAP 13 h obecne dwa przedjądrza

10. 6-DMAP + PMA lub CHX • PMA i CHX użyto , aby sprawdzić czy 6-DMAP przyspiesza wejście w interfaze także w ich obecności. • Przyspiesza, ale nie tak silnie jak w obecności A23187.

11. Tabela przedstawia jaki procent oocytów poddanych działaniu określonych czynników utworzył jądro w określonym czasie.

12. 6-DMAP • W oocytach traktowanych 6-DMAP wrzeciono podzialowe zaniklo w ciągu 3-4h. Chromosomy pozostały skupione razem; oocyty pozostały w metafazie- były krótsze i grubsze niż w kontroli. • Niewielka liczba oocytów uległo aktywacji. • Brak korelacji pomiędzy procentem oocytów zaktywowanych w kontroli i poddanych działaniu 6-DMAP. • Zwiększenie stężenia 6-DMAP nie powoduje zwiększenia liczby oocytów zaktywowanych. • Oocyty przeniesione do MEM na 18 h po 4h inkubacji w 6-DMAP posiadały odtworzone wrzeciono podziałowe- efekt działania 6-DMAP na mikrotubule jest odwracalny.

13. Oocyty w 6-DMAP tworzą jadro bardzo gwałtownie – gwałtowniej niż w wyniku działania innych substancji, lecz nie tak gwałtownie jak w przypadku stosowania kombinacji różnych substancji. • Około 20% oocytów posiadało 2 jądra – w wyniku oddzielenia się chromosomów . Większość posiadała 1 jądro.( diploidalne ) • W żadnym z oocytów nie zaobserwowano ciałka kierunkowego.

14. A:kontrola • B:6-DMAP • C:6-DMAP 4 h MEM 18h • D:6-DMAP 1h oddzielone chromosomy • E:6-DMAP 3h

15. Podsumowanie • 6-DMAP uniemożliwia fosforylacje białek w około 20% mysich oocytów w metafazie II. • Kinaza białkowa C (PKC) jest aktywowana przez PMA . Są dowody na to , iż 6-DMAP i PKC działają w podobny sposób. • Fosforylacja i aktywacja kinazy MAP jest hamowana przez 6-DMAP.

16. MAP • Niezbędna do aktywacji CSF - 6-DMAP pwoduje,że oocyty przchodzą do interfazy. • Powoduje , ze MPF jest stabilny • Niezbędna do utworzenia wrzeciona podziałowego- w oocytach traktowanych 6-DMAP zanikło wrzeciono podziałowe.

17. Jeśli u myszy MAP jest częścią CSF ( tak jak u Xenopus ) to 6-DMAP hamuje aktywność CSF. • W oocytach małż i żab 6-DMAP zapobiega degradacji cykliny B – proteoliza cykliny B jest niezbędna do inaktywacji MPF i wyjścia z metafazy.Jeśli podobnie jest u myszy to powinien on utrudniać wyjście z metafazy-może dlatego tylko cześć oocytów została zaktywowanych. • Może 6-DMAP destabilizuje CSF , ale aktywacja zachodzi tylko wtedy gdy MPF nie był wystarczająco aktywny aby oocyt mógl pozstać w metafazie. • W oocytach w metafazie III aktywacje powoduje chwilowe zmniejszenie ilości MPF.

18. Aby MPF był obecny w oocycie musi zachodzić ciągła synteza białek oraz fosforylacja przez kinazy wrażliwe na 6-DMAP. • Sygnały aktywujące oocyt mogą pozbawiać oocytu fosfoprotein , które wpływają na aktywność MPF. • „Młode oocyty” mogą mieć większy poziom fosfoprotein i dlatego przechodzą do stadium metafazy III.