1 / 136

Molekulārās metodes mikrobioloģijā

Molekulārās metodes mikrobioloģijā. Teorija 5 . Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR). PCR. PCR. PCR. DNS izdalīšana no gela. Agarozes gels: E). PCR1 + PCR2 + H 2 O 1 : 1 : 8 = = N2. DNS izdalīšana no gela. Agarozes gels: E). PCR1 + PCR2 => PCR3

armen
Download Presentation

Molekulārās metodes mikrobioloģijā

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Molekulārās metodes mikrobioloģijā Teorija 5. Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  2. PCR Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  3. PCR Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  4. PCR Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  5. DNS izdalīšana no gela Agarozes gels: E) PCR1 + PCR2 + H2O 1 : 1 : 8 = = N2 Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  6. DNS izdalīšana no gela Agarozes gels: E) PCR1 + PCR2 => PCR3 bez praimeriem PCR3 + H2O 1 : 9 = N7 Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  7. PCR N2 N7 Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  8. PCR PCR - metode noteiktu, nelielu (līdz 2 kbp) DNS fragmentu pavairošanai. PCR pamatā ir ciklizēta DNS sintēze in vitro. PCR tiek izmantoti dabīgo DNS replikācijas sistēmu elementi. PCR nav noderīga visa organisma genoma pavairošanai. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  9. PCR Izmantojot PCR var: Izdalīt un pavairot vajadzīgo DNS fragmentu no kompleksiem nukleīnskābjumaisījumiem, Analīzei nepieciešamo DNS fragmentuiegūt vajadzīgajā daudzumā no nelielaapjomavai stipri bojāta izejmateriāla. (1 => 1 000 000) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  10. PCR Vairumā gadījumu PCR ir tikai metode DNS pavairošanai. Lai analizētu PCR iegūto DNS fragmentu ģenētisko informāciju, nākas izmantot citas molekulārās bioloģijas metodes. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  11. DNS pavediena uzbūves shema Purīnu vai pirimidīnu bāze Fosfodiestera saite Riboze Nukleotīds Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  12. Purīnu bāzes: Purīns Adenīns (A) Guanīns (G) - ūdeņraža saite - glikozīdiskā saite Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  13. Pirimidīnu bāzes: Pirimidīns Citozīns (C) Timīns (T) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  14. Bāzu komplementaritāte nodrošina DNS sintēzi pēc matrices principa. Adenīns (A) Timīns (T) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  15. Bāzu komplementaritāte nodrošina DNS sintēzi pēc matrices principa. Guanīns (G) Citidīns (C) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  16. A T T A G C C G Bāzu komplementaritāte nodrošina DNS sintēzi pēc matrices principa. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  17. Bāzu komplementaritāte 3’ 5’ 5’ 3’ Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  18. Bāzu komplementaritāte Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  19. DNS Parastos apstākļos DNS pastāv divpavedienu formā. Ūdeņraža saišu veidošanās starpkomplementārajām bāzēm ir enerģētiski izdevīga. Ūdeņraža saišu pārraušana ir DNS denaturācijas procesa pamatā. Ūdeņraža saišu atjaunošanos starpkomplemen-tārajām bāzēm sauc par DNS renaturēšanos. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  20. DNS sintēzes laikā nukleotīdi, izmantojot ūdeņraža saišu veidošanos starp komplementārajām bāzēm, saistās pie vienpavediena matrices un pēc tam tiek polimerizēti, veidojot jaunu DNS pavedienu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  21. Tāpēc DNS sintēzei nepieciešama vienpavediena DNS matrice. A A A G T T C C A G T C A G C G T C G CAGGCTTCATAGCTCCT C G ||| || ||| ||| ||| || || ||| || || || ||| ||| || ||| ||| || | | ||| GTCCGAAGTATCGAGGAAGCTCCGTA T G T C C A Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  22. DNS sintēze Ja pret nukleotīdu matricē nostājies tam komplementārais nukleotīds: • Izveidojas ūdeņraža saites • Nukleotīdsšajā vietā uzkavējas ilgāk • Nukleotīds atrodas pareizā telpiskā novietojumā Šādus apstākļus izmanto DNS polimerāze, lai katalizētu jaunas fosfodiestera saites izveidi. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  23. DNS sintēze Vienpavediena DNS var iegūt (DNS var denaturēt): • Ar stipri sārmainu vidi (pH>10) • Ar paaugstinātu temperatūru (virs 90o C) • Izmantojot molekulas, kuras ar purīna vai pirimidīna bāzēm labi veido ūdeņraža saites - • urīnviela, • formamīds, • SSB proteīni (vienpavediena DNS saistītājproteīni) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  24. DNS polimerāzes DNS polimerāzes ir enzīmi,kas - katalizē DNS molekulas sintēzi no - dezoksiribonukleotīdtrifosfātiem (dNTP) - pievienojot tos jau esoša DNS pavediena 3’ gala hidroksil-grupai, - katalizējot fosfodiestera saites izveidi. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  25. DNS polimerāzes 5`-TGCATGCA-OH 3` 3`-ACGTACGTACGTACGTACGTACGT-5` matrice Bioloģiskajās sistēmās vienmēr: • DNS sintēze notiek virzienā no 5’ gala uz 3’ galu. • DNS polimerāze pa matricu pārvietojas virzienā no 3’ gala uz 5’ galu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  26. DNS polimerāžu darbības ātrums optimālos apstākļos ir 50 - 500 nt. / sekundē E. coli genoms (4*106 bp.) replicētos 2 stundās. Cilvēka genoms (3*109 bp.) replicētos 694 dienās (ja nebūtu dalīts atsevišķās hromosomās). Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  27. DNS polimerāzes pēc izmantotās matricas iedala: DNS atkarīgās DNS polimerāzēs, kuras DNS sintezē uz DNS matrices. RNS atkarīgās DNS polimerāzes, kuras par matricēm izmanto RNS molekulas. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  28. DNS polimerāzes Kā izejas bloki DNS sintēzei tiek izmantoti dezoksiribonukleotīdu trifosfāti (dNTP), kuri satur divas makroerģiskās fosfātu anhidrīdsaites. dNTP = dATP + dCTP + dGTP + dTTP Makroerģiskā saite starp a un b fosfātu grupām tiek izmantota DNS sintēzes enerģijas iegūšanai. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  29. DNS sintēze OH OH Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  30. DNS sintēze O OH Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  31. Daudzām DNS polimerāzēm piemīt ne tikai DNS polimerāzes aktivitāte, bet arī eksonukleāzes aktivitātes. EksonukleāzeDNS pavediena noārdīšanu katalizē no polimēra brīvā gala (pretstatā endonukleāzēm). Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  32. DNS polimerāzes Var būt divu veidu eksonukleāzes aktivitātes: 5’=>3’ eksonukleāze 3’=>5’ eksonukleāze Eksonukleāzes aktivitātes atkarībā no polimerāzes pielietojuma var būt gan noderīgas, gan traucējošas. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  33. DNS polimerāzes - 5’=>3’ eksonukleāzes aktivitāte - attīra ceļu DNS polimerāzeino veciem DNS pavediena gabaliem. 5`-TGCATGCA-3` GGCATGCA 3`-ACGTACGTACGTACGTACGTACGT-5` matrice Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  34. DNS polimerāzes - 3’=>5’ eksonukleāzes (“proofreading” aktivitāte) - labo pieļautās DNS sintēzes kļūdas. 5`-TGCATGCT-3` 3`-ACGTACGTACGTACGTACGTACGT-5` matrice T 5`-TGCATGC-3` 3`-ACGTACGTACGTACGTACGTACGT-5` matrice Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  35. DNS sintēzes kļūdas DNS satāvā ietilpstošajās heterocikliskajās bāzēs var notikt īslaicīga elektronu un protonu pārgrupēšanās, kā rezultātā veidojas bāzu tautomērās formas. Tautomēro formu rašanās biežums un pastāvēšanas ilgums nosaka, ka katrā laika momentā tautomērajā formā ir: 1 no 104 līdz 1 no 105bāzēm. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  36. Bāzu tautomērās formas Heterociklisko bāzu tautomēro formu pastāvēšanas laikā iespējama to nepareiza pārošanās (komplementaritāte): A C T C A G T G Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  37. 3' => 5' eksonukleāzes aktivitāte izlabo lielāko daļu bāzu tautomērijas radīto kļūdu. Tomēr, lai sasniegtu in vivo vērojamo DNS sintēzes precizitāti (1 kļūda uz 109 nt.) nepieciešamas vēl citas kļūdu labošanas sistēmas. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  38. 3' => 5' eksonukleāzes aktivitāte jauz matrices uzsintezēti tikai daži nukleotīdi, polimerāzes 3’=>5’ ekzonukleāzes aktivitāte nevar veiksmīgi izpausties, tādēļlielākā daļa DNS polimerāžu uzsāk sintēzi tikai no labi sapārota nukleīnskābju pavediena brīva 3’ gala. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  39. DNS polimerāzes 5` -C-OH 3` 3`-ACGTACGTACGTACGTACGTACGT-5` matrice RNS vai DNS praimeris (ierosa) 5`-TGCATGCA-OH 3` 3`-ACGTACGTACGTACGTACGTACGT-5` matrice Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  40. In vivo Par praimeri kalpo 10 - 20 nt. gara RNS molekula, kuru sintezē īpašs enzīms - preimāze - DNS atkarīga RNS polimerāze. PCR Par praimeriem izmano sintētiskus 10 - 30 nt. garus DNS oligonukleotīdus. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  41. DNS replikācija In vivo Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  42. PCR Priekšvēsture Pavairojot divpavediena DNS, galvenās problēmas sagādā DNS denaturācija: • Helikāze un SSB proteīni in vitronav veiksmīgi izmantojami - sistēma kļūst pārāk sarežģīta. • Sārmaina vide, urīnviela, formamīds, augsta temperatūra - inaktivē DNS polimerāzes. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  43. PCR Priekšvēsture Sākotnēji DNS sintēziei in vitro raudzīja izmantot E. coli DNS Polimerāzi I un tās atvasinājumus. Tam vairāki iemesli: • E. coli labi raksturots mikroorganisms, ātri un viegli savairojams, iegūtas drošas līnijas, • Enzīmu veido viena polipeptīda molekula (109 kDa). • Labi aprakstītas enzīma izdalīšanas un attīrīšanas metodes. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  44. DNS polimerāzes E. coli DNS polimerāze I(DNS Pol I) No viena polipeptīda sastāvošs enzīms ar molekulmasu 109 kDa. E. coli DNA Pol I piedalās DNS reparācijā un arī replikācijā (bet nav galvenais DNS replikācijas enzīms). Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  45. DNS polimerāzes DNS Pol I piemīt visas 3 aktivitātes: - DNS polimerāzes; - 5’=>3’ eksonukleāzes; - 3’=>5’ eksonukleāzes (“proofreading” aktivitāte). Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  46. DNS polimerāzes E. coli DNS polimerāzes Iciti pielietojumi: • DNS polimerāzes aktivitāti izmanto, lai sintezētu komplementārās DNS (cDNS) otro pavedienu. • Izmanto DNS iezīmēšanai ar nik-translācijas (nick-translation) metodi. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  47. DNS polimerāzes Klenova fragments Iegūst 1974. gadā, šķeļot E. coliDNS Pol I ar proteāzi - subtilizīnu, ko iegūst no Bacillus subtilis 5’=>3’ eksonukleāzes aktivitāti nosakošais proteīna domēns atrodas N-galā un to iespējams atdalīt, saglabājot tikai C-daļu ar polimerāzes un 3’=>5’ eksonukleāzes aktivitāti, kā tas vērojams Klenova fragmenta gadījumā. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  48. DNS polimerāzes Klenova fragments Patlaban Klenova fragmentu iegūst ekspresējot E. coli klonētu DNS Pol I gēnu, kas kodē tikai nepieciešamo proteīna daļu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  49. DNS polimerāzes Klenova fragmentu izmanto: • DNS fragmentu galu 5’ pārkaru aizpildīšai • DNS fragmentu galu iezīmēšanai, lietojot [a-32P]dNTP Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  50. DNS polimerāzes Klenova fragmenta izmantošana: • DNS nukleotīdu secības noteikšanai (sekvenēšanai) pēc Sangera didezoksiterminatoru metodes; • 3’=>5’ eksonukleāzes aktivitāti var izmantot, lai “strupinātu” DNS fragmentu 3’ pārkares, kuras veidojas pēc DNS šķelšanas ar dažām restriktāzēm; Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

More Related