Autor Magdalena Słowik Akademia Rolnicza w Lublinie Instytut Nauk Rolniczych w Zamościu

1. Oddziaływanie Cyperkillu Super 25 EC – preparatu z grupy pyretroidów na system antyoksydacyjny komórek drożdży Sacharomyces cerevisiae. Autor Magdalena Słowik Akademia Rolnicza w Lublinie Instytut Nauk Rolniczych w Zamościu Międzywydziałowe Studium Pedagogiczne Zamość 2007

2. Praca magisterska wykonana w Instytucie Nauk Rolniczych w Zamościu pod kierunkiem dr Anny Krzepiłko Zamość 2003

3. Spis treści: • 1. Pestycydy – charakterystyka ogólna. • 1.1. Główne grupy pestycydów. • 1.2. Podział pestycydów ze względu na klasy toksyczności. • 2. Syntetyczne insektycydy pyretroidowe. • 2.1. Cypermetryna. • 3. Reakcje niespecyficzne wywoływane przez pyretroidy. • 4. System antyoksydacyjny. • 5. Wybór drożdży do badań. • 6. Cel pracy. • 7. Materiały i metody. • 8. Wyniki. • 9. Wnioski.

4. 1. Pestycydy – charakterystyka ogólna. • Pestycydy to substancje przeznaczone do: • - zwalczania organizmów zwierzęcych, • - zwalczania patogenów wywołujących choroby roślin, • - zwalczania chwastów i roślin niepożądanych, nie będących chwastami, • - regulowania lub stymulowania wzrostu roślin lub części roślin, • - zwalczania organizmów zwierzęcych niszczących produkty roślinne, • - zwalczania czynników powodujących psucie się produktów roślinnych, • - zwalczania organizmów zwierzęcych lub mikroorganizmów w budynkach, • - zwalczania organizmów będących czynnikami chorobotwórczymi dla człowieka lub zwierząt.

5. 1.1. Główne grupy pestycydów. • - zoocydy; • insektycydy – substancje owadobójcze, • akarcydy – substancje roztoczobójcze, • nematocydy – substancje nicieniobójcze, • rodentycydy – substancje gryzoniobójcze, • moluskocydy – substancje ślimakobójcze, - herbicydy – substancje chwastobójcze; - fungicydy – substancje grzybobójcze.

6. 1.2. Podział pestycydów ze względu na klasy toksyczności. • Toksyczność ostra - określana przez wartość LD50 – wartość dawki przyjmowanej doustnie (per os) przypadającej na osobnika. • LD50 jest to ilość substancji aktywnej preparatu powodująca śmierć połowy (50%) badanych osobników wyrażona w miligramach substancji aktywnej na kilogram masy ciała.

7. Tabela 1. Podział pestycydów na klasy toksyczności obowiązujący w Polsce.

8. 2. Syntetyczne insektycydy pyretroidowe. • Jedną z grup insektycydów stosowanych w rolnictwie są insektycydy pyretroidowe. • - są to estry kwasu chryzantemowego (lub pochodnych tego kwasu) i alkoholi pierwszo- lub drugorzędowych zawierających w cząsteczce przynajmniej jedno wiązanie podwójne, • - odznaczają się szczególnie dużą siłą działania na układ nerwowy owadów, • - nie wykazują tendencji do kumulowania się w żywych organizmach,

9. - wybitna toksyczność dla owadów i niewielka dla ssaków umożliwia względnie bezpieczne stosowanie tych insektycydów w niewielkich dawkach wynoszących 10 – 30 g/ha, - uczyniły one ochronę roślin skuteczniejszą i mniej szkodliwą dla roślin uprawnych i zwierząt hodowlanych, - pozwoliły wyeliminować lub ograniczyć zasięg stosowania wielu insektycydów chloroorganicznych i fosforoorganicznych, bardziej szkodliwych dla środowiska, - zaliczane są do III i IV klasy toksyczności ostrej dla ludzi, - ulegają szybkiej biodegradacji w organizmach ssaków i innych kręgowców.

10. 2.1. Cypermetryna. • - insektycyd pyretroidowy, • - stosowana do ochrony: • upraw rolniczych (buraki, chmiel, groch, kapusta pastewna, marchew pastewna, peluszka, tytoń, ziemniak); • warzyw polowych (bób, fasola, groch, pomidor, cebula); • warzyw szklarniowych (ogórek, papryka, pomidor); • roślin ozdobnych (anturium, frezja, gerber, goździk); • upraw sadowniczych (agrest, brzoskwinia, grusz, czereśnia, jabłoń, leszczyna, malina, morela, porzeczka, śliwa, wiśnia); • upraw zielarskich; • budynków magazynowych;

11. - wyróżnia się dużą odpornością na degradację fotochemiczną, • - zwalcza następujące gatunki owadów: • na polach – bielinki, chowacze, pchełki, rolnice, skoczogonki, słodyszek rzepakowy, stonka ziemniaczana, strąkowce, wciornastki, zmieniki, miodownice, skoczek sześciorek; • w szklarniach– mączlik szklarniowy, mszyce, wciornastki, opuchlak truskawkowy; • w sadach– brudnica nieparka, kistnik malinowy, kwieciaki, miodówki, namiotniki, owocówki, pasynki, szrotówki, pierścienica nadrzewna, piłecznica agrestowa, pryszczaki, przezierniki, słonkowiec orzechowy, zwójki; • w uprawach zielarskich – opuchlaki, oprzędziki, pędrusie, piętnówki, pluskwiaki, stonki, skoczkowate, tarczyki.

12. 3. Reakcje niespecyficzne wywoływane przez pyretriody. • - mogą wpływać na aktywność wielu enzymów min. odpowiedzialnych za usuwanie wolnych rodników i ochronę antyoksydacyjną komórek, • - mogą powodować procesy starzenia, • - mogą powodować nietypowe procesy metaboliczne, • - nasilają peroksydacje lipidów, • - mogą wpływać cytotoksycznie i genotoksycznie na komórki, • - mogą generować powstawanie reaktywnych form tlenu,

13. - w obecności związków działających z nimi synergicznie mogą być szkodliwe nawet w niewielkich dawkach, - reakcji na pyretroidy może towarzyszyć zaburzenie homeostazy antyoksydacyjno-prooksydacyjnej komórki, czego następstwem jest stres oksydacyjny, - u człowieka mogą być powodem zatruć, bólów głowy, nerwowości, ogólnego osłabienia, mdłości, podrażnienia skóry i błon śluzowych nosa.

14. 4. System antyoksydacyjny. • Rolą systemu antyoksydacyjnego jest usuwanie lub kontrola (regulacja) powstawania wolnych rodników w komórkach, tkankach i organach. • Mechanizmy obronne chroniące przed toksycznym działaniem wolnych rodników zlokalizowane są na dwóch poziomach: • - poziom nieenzymatyczny – tworzą go niskocząsteczkowe związki, które reagując z cząsteczkami o charakterze wolnorodnikowym, hamują rozprzestrzenianie się reakcji wolnorodnikowych, „wygaszają” wzbudzone cząsteczki tlenu i dysmutują rodniki ponadtlenkowe; • - poziom enzymatyczny – główne funkcje antyoksydacyjne pełnią enzymy zaliczane do klasy oksydoreduktaz: katalazy, dysmutazy ponadtlenkowe i peroksydazy.

15. Naturalnymi antyoksydantami występującymi w układach biologicznych są: - witaminy (A, E, C, K), - selen, - związki z grupami tiolowymi np. glutation, - pochodne kwasu galusowego, - ubichinon, - moczan, - glukoza.

16. 5. Wybór drożdży do badań. • - modelowe organizmy do badań nad oddziaływaniem ksenobiotyków na organizmy żywe, • - od wielu lat są obiektem badań nad różnymi aspektami biologii komórek eukariotycznych, umożliwiającym analizę wielu procesów na poziomie komórkowym, • - stanowią dogodny obiekt do badań nad mechanizmami powstawania i oddziaływania wolnych rodników na komórki, • - system antyoksydacyjny w komórkach drożdży jest podobny pod wieloma względami do systemu obecnego w komórkach organizmów wyższych, • - odpowiedz komórek drożdży na czynniki stresowe ma wiele cech wspólnych z odpowiedzią charakterystyczną dla innych komórek eukariotycznych.

17. 6. Cel pracy. Celem prezentowanej pracy jest określenie wpływu insektycydu Cyperkill Super 25 EC zawierającego cypermetrynę jako substancję biologicznie czynną na: - aktywność głównych enzymów antyoksydacyjnych drożdży S. cerevisiae: dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy; - odpowiedz stresową komórek drożdży; - zmiany poziomu wewnątrzkomórkowego zredukowanego glutationu i potencjału oksydoredukcyjnego w komórkach drożdży.

18. 7. Materiały i metody. • Szczep drożdży; - do badań użyto standardowy szczep drożdży SP-4 o genotypie alfa leu 1 agr 4, • Warunki hodowli; - drożdże hodowano na pożywce płynnej YPG, w warunkach aerobowych, • Badanie przeżywalności populacji komórek drożdży po inkubacji z pyretroidem; • Oznaczanie aktywności katalazy T metodą wolumetryczną; • Oznaczanie aktywności dysmutazy ponadtlenkowej metodą adrenalinową;

19. Badanie wpływu preparatu Cyperkill Super 25 EC na aktywność katalazy w warunkach:- stresu termicznego (gwałtowne podwyższenie temperatury hodowli z 22ºC do 38ºC),- stresu osmotycznego (dodanie do hodowli roztwór NaCl o stężeniu 0.3 M); Barwienie komórek drożdży: - przy pomocy barwnika fluorescencyjnego mBCl - stwierdzenie obecność wewnątrzkomórkowego zredukowanego glutationu,- barwienie RedoxSensor Red - określenie potencjału oksydoredukcyjnego komórk.

20. 8. Wyniki. • Otrzymane wyniki są średnią z przynajmniej trzech niezależnie przeprowadzonych doświadczeń. • 1) Stwierdzono, że cypermetryna wpływa na przeżywalność komórek drożdży, a efekt jej działania zależał od stężenia (Tabela 2). Wyniki tego eksperymentu przedstawiono także w postaci krzywej przeżywalności (Rysunek 1.).

22. 2. Zbadano wpływ preparatu Cyperkill Super 25 EC na aktywność katalazy (Tabela 3.). W próbie kontrolnej stwierdzono typowy dla fazy późno logarytmicznej poziom aktywności katalazy. W próbach inkubowanych z pyretroidem stwierdzono, że aktywność katalazy w komórkach drożdży była niższa od wartości uzyskanych w próbie kontrolnej, bez pyretroidu. Graficzną interpretację wyników przedstawiono na wykresie (Rysunek 2.)

24. 3. Równoczesne zastosowanie szoku termicznego (38ºC) i pyretroidu oraz szoku solnego (0.3 M NaCl) i pyretroidu spowodowały, że aktywność katalazy w komórkach drożdży była niższa niż w próbie poddanej tylko działaniu szoku termicznego. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli (Tabela 4., 5.) a ich graficzną interpretację na wykresie (Rysunek 3., 4.)

27. 5. W próbach inkubowanych z preparatem Cyperkill Super 25 EC stwierdzono, że aktywność SOD (dysmutazy ponadtlenkowej) w komórkach drożdży była niższa od wartości uzyskanych w próbie kontrolnej. W próbie kontrolnej stwierdzono typowy dla fazy późno logarytmicznej poziom aktywności dysmutazy. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli (Tabeli 6.), a ich graficzną interpretację na wykresie (Rysunek 5.)

29. 6. Metodą barwienia fluorescencyjnego z mBCl stwierdzono jakościowe zmiany stężenia zredukowanego glutationu w komórkach inkubowanych z cypermetryną o stężeniu 250 μg/cm3. Komórki z próby kontrolnej wybarwione mBCl charakteryzują się intensywnie zieloną fluorescencją, podczas gdy komórki inkubowane z pestycydem bardzo słabo fluoryzowały. 7. Wybarwiając komórki drożdży barwnikiem RedoxSensor Red stwierdzono wpływ preparatu Cyperkill Super EC na zmiany potencjału redoks w komórkach drożdży. Komórki z próby kontrolnej charakteryzowały się intensywnie czerwoną fluorescencją. Natomiast komórki drożdży inkubowane przez 1 h z dawką cypermetryny 250 µg/cm3 i barwione barwnikiem RedoxSensor Red bardzo słabo fluoryzują, co wskazuje na zaburzenia potencjału redoks komórki.

30. 9. Wnioski. • Na podstawie przeprowadzonych doświadczeń można wyciągnąć następujące wnioski: • 1. Insektycyd Cyperkill Super 25 EC jest związkiem toksycznym dla drożdży S. cerevisiae. Cypermetryna o stężeniu 250 μg/cm3 powoduje około 50% śmiertelność populacji komórek drożdży. Wyższą śmiertelność komórek stwierdzono podczas inkubacji z roztworem cypermetryny o stężeniu powyżej 325 μg/cm3. • 2. Inkubacja komórek drożdży z preparatem Cyperkill Super 25 EC zawierającym cypermetrynę o stężeniu 175-325 μg/cm3 powodowały spadek aktywności katalazy. Jedynie aktywność katalazy w komórkach drożdży inkubowanych z tym insektycydem o stężeniu 150 μg/cm3 była o 143% wyższa niż w próbie kontrolnej.

31. 3. W warunkach stresu termicznego i stresu solnego preparat Cyperkill Super 25 EC hamował indukcję katalazy T w komórkach drożdży S. cerevisiae. 4. Inkubacja komórek drożdży z preparatem Cyperkill Super 25 EC zawierającym cypermetrynę o stężeniu 250 μg/cm3 powodowała spadek aktywności dysmutazy ponadtlenkowej. 5. Preparat Cyperkill Super 25 EC powodował znaczne osłabienie fluorescencji komórek barwionych barwnikami mBCl i RedoxSensor Red TMRed co wskazuje na obniżenie stężenia poziomu zredukowanego glutationu i zaburzenia równowagi redoks w komórkach drożdży.