实验 19 Northern blot

实验 19 Northern blot

目的 1．定量分析某一特定基因mRNA的转录与否，以及转录的水平。 2．比较两个或两个以上不同组织某一已知基因转录的差异。 3．比较两个或两个以上不同组织某一未知基因转录的差异。

由于此方法具有稳定、可靠、假阳性少等特点，多年来一直深受广大研究者的喜爱。其结果可以同时反映某一特定基因RNA分子量的大小及其数量。在中医药实验中通常以此来判别某一中医药方法对某一已知基因转录的调控作用。例如我们的GnRH、N-ras、白蛋白等研究。由于此方法具有稳定、可靠、假阳性少等特点，多年来一直深受广大研究者的喜爱。其结果可以同时反映某一特定基因RNA分子量的大小及其数量。在中医药实验中通常以此来判别某一中医药方法对某一已知基因转录的调控作用。例如我们的GnRH、N-ras、白蛋白等研究。通常观察某一分子的变化有两个层次，蛋白水平的和核酸水平的。两者的含量变化均与其生成、代谢有关，而两者的作用发挥还关系到其质量、修饰、环境条件等因素，这些变化采用观察蛋白与核酸的量是不能回答的，所以对Northern blot的结果要有客观的分析。类似的实验主要为RT-PCR。

原理 采用变性凝胶电泳，使RNA分子由小到大排列于凝胶之中。应用虹吸原理，将RNA转移至硝酸纤维素膜，烘干，使RNA牢固地结合在硝酸纤维素膜上。与放射性标记的探针杂交，杂交后，洗去未被杂交上的探针和游离的同位素，将硝酸纤维素膜放射自显影，使胶片上出现对应于相应分子量mRNA的条带。最后，对条带进行光密度扫描，并统计分析。

实验准备 （参考教材）

实验步骤 1．RNA电泳取10ug RNA旋转真空干燥，溶于20ul新配的样品缓冲液。置样品于65℃水浴中5分钟，迅速移入冰中冷却，再加4ul上样缓冲液，混匀。移胶至电泳槽内，注入电泳缓冲液1×MOPS，浸没凝胶，轻轻拔去疏子。接通电源，负极靠近上样孔。吸取样品24ul，注入上样孔内。开启电源，电压调至100V。电泳约2小时，至溴酚蓝移至前缘时，关闭电源。轻轻取出凝胶，移至紫外透射反射分析仪上检查电泳结果。在凝胶一侧放把尺，拍照。

2．RNA转移至硝酸纤维素膜 取一洁净的容器，注入20×SSC，容器上缘架一水平玻璃板。取2～4层滤纸，纸宽同凝胶长，纸长足以经玻璃板两侧浸入20×SSC中。待滤纸全都湿透后，滚动移液管赶走滤纸间及其与玻璃板间的气泡。切去凝胶上样孔及以上部分，在凝胶第一上样孔处切去一小角，作为记号，把凝胶底朝上放于滤纸上，用移液管赶走凝胶与滤纸间的气泡。把硝酸纤维素膜裁成凝胶大小，对应凝胶剪去一小角，先浸湿于双蒸水中，再浸于20×SSC中，取出平放于凝胶之上，缺角处与凝胶缺角处对齐。用移液管赶走凝胶与硝酸纤维素膜间的气泡。膜上置2～4层20×SSC浸湿的滤纸，用移液管赶走滤纸与硝酸纤维素膜间的气泡。

用4张保鲜膜沿凝胶4侧盖住凝胶旁的滤纸、玻璃和容器，以防止凝胶外形成虹吸短路，以及容器内的缓冲液干燥。在胶上滤纸之上方，铺4～6厘米厚的卫生纸，上置一平玻板，玻板上压一300～500克的重物。过夜。用4张保鲜膜沿凝胶4侧盖住凝胶旁的滤纸、玻璃和容器，以防止凝胶外形成虹吸短路，以及容器内的缓冲液干燥。在胶上滤纸之上方，铺4～6厘米厚的卫生纸，上置一平玻板，玻板上压一300～500克的重物。过夜。次日上午，取出凝胶与硝酸纤维素膜，在透射紫外灯仪上确认RNA已全部转移至硝酸纤维素膜上。把该膜夹于两张洁净的滤纸间，在80℃真空干燥箱中真空干燥两小时。

3．探针标记（此工作与膜转移于同一天进行）3．探针标记（此工作与膜转移于同一天进行）水14 ul OLB5 ul BSA （ 10mg/ml ）1 ul DNA （ 30～50 ng） 2 ul 100℃×5min, 37℃×10min, 4℃×5min α[32P]dCTP （50uCi） 2.5 ul 大肠杆菌聚合酶K片段0.5 ul 混匀，4℃ 过夜，次日再加：大肠杆菌聚合酶K片段0.5 ul 半小时后加入终止液50 ul

4．离心柱分离探针 （1）柱的制备取消毒过的蓝吸头，用小玻璃珠或玻璃纤维放入吸头，堵住出口，将混匀的Sephadex G50（中号）移入吸头至满。取1.5ml Eppendorf管，剪去盖，放入10ml离心管中。将蓝吸头插入Eppendorf管，可自制一套圈或用一垫圈套于蓝吸头前部，以保证吸头尖距1.5ml管底部约1～2厘米。1600×g离心4分钟，弃去1.5ml管中的TE液，再用100ul TE液加入小柱，离心，如此反复两次平衡柱子。

（2）分离 用镊子取出原1.5ml管，取一新的1.5ml管放入10ml离心管，插上平衡过的小柱。将标记的探针液，加入小柱，1600×g离心4分钟，小心取出1.5ml管，将分离的到的探针移入一标签过的1.5ml管，盖紧盖子。

5．探针变性 将含探针的1.5ml管置于沸水中5分钟变性，迅速移入冰中冷却。 6．杂交将硝酸纤维素膜在2×SSC中浸湿，以防碎裂，然后放入杂交袋中，四周封口，剪去一角注入10毫升预杂交液，挤去气泡，封口，置此袋于40℃水浴摇床中摇晃预杂交1小时以上。取出袋，拭干，剪去一角，将变性了的探针加入，挤去气泡，封口。为防止含同位素的探针泄漏，外再封一杂交袋。置此袋于40℃水浴摇床中摇晃杂交过夜。

7．洗膜 取出袋，拭干，剪去一角，将杂交液注入50ml管中，存于4℃冰箱，以备再用。剪去袋的四周，置此袋于2×SSC/0.1％SDS液中，取出膜，晃洗于此液。移膜入新的2×SSC/0.1％SDS液中，于50℃中晃洗半小时，如此重复一次。 8．曝光取上膜封于杂交袋中。在暗室中打开片盒，放X光胶片于增感屏上，再放上膜，盖上盒，将片盒存于-70℃冰箱中。一天后冲片，视显影强弱，缩短或延长曝光时间。

实验结果 1．电泳后，凝胶在紫外透射反射分析仪上可清楚地见到18S、28S两条明显的橘红条带，以及前后不等强度的橘红显色。

2．X光胶片上可见杂交带。杂交背景低。 3．如果比较不同样品的话，可能会见到在同一分子量的区域见有曝光深浅不等的杂交带，为了准确定量，可以借助于激光光密度计扫描分析。

注意事项 1．本方法采用同位素标记，整个实验过程中务须严格遵守同位素操作规则，注意安全。 2．实验过程中，由于RNA容易被RNA酶降解，因此，要注意无菌操作，以防RNA酶污染。 3．硝酸纤维素膜在剪取等操作过程中，不要被污染与破碎，更不能直接用手拿，而应用扁平摄子小心摄取。 4．在使用虹吸法将RNA转移至硝酸纤维素膜上时，要注意将气泡排除干净，并且用保鲜膜封好凝胶四周，以免形成短路，使转移失败，这样的事例不少见。

5．含有RNA的硝酸纤维素膜80℃干燥后，如果实验必须中断，可将硝酸纤维素膜用保鲜袋包好，保存于-20℃冰箱中。5．含有RNA的硝酸纤维素膜80℃干燥后，如果实验必须中断，可将硝酸纤维素膜用保鲜袋包好，保存于-20℃冰箱中。 6．如果作某一基因表达的半定量分析，可以同时或分别与内参基因探针杂交，以明确不同样本的上样量是否一致。方法是将目的基因光密度与内参基因光密度的比值作为半定量参数，进行统计分析。 7．硝酸纤维素膜洗去探针后可用于新探针的杂交。洗去探针的方法如下：把硝酸纤维素膜置于70℃的0.1×SSC/0.1％SDS中晃洗20分钟，弃去此液，如此条件洗3次。通常一张膜可以反复杂交3次以上。

8．用于Northern blot实验中固定RNA的材料主要有硝酸纤维素膜与尼龙膜。其中硝酸纤维素膜具有成本低、杂交信号本底较低等优点；同时，也有对结合力不够强、重复使用的次数不多等缺点。而尼龙膜具结合力强、可反复使用等优点；却有成本高、杂交信号高等缺点。可以根据实验室的具体情况和经验选用。

9．用于核酸杂交的分子探针有DNA探针、cDNA探针、RNA探针以及人工合成的寡核苷酸探针等多种。Northern blot技术最合适的探针为cDNA探针。如果选用基因组DNA探针时，要尽可能使用基因的编码序列（外显子部分）作为探针，而避免使用内含子及其它非编码序列，否则探针中可能因高度重复序列存在引起非特异性杂交而出现假阳性结果。RNA探针因为操作不方便，常不被采用。寡核苷酸探针较适合于基因点突变分析，但是由于这类探针分子量小，标记后不容易纯化，往往给实验带来困难。

10．用于核酸杂交的分子探针的标记物有同位素、生物素、地高辛、荧光素等。其中，同位素是目前国内外研究中应用最多的一类探针标记物，因其具有灵敏度高、特异性强、杂交本底低等优点。而且，其曝光时间可以随意调节，以获得最佳曝光效果；实验结束，膜经洗脱后可以反复使用多次，这也是其优点。10．用于核酸杂交的分子探针的标记物有同位素、生物素、地高辛、荧光素等。其中，同位素是目前国内外研究中应用最多的一类探针标记物，因其具有灵敏度高、特异性强、杂交本底低等优点。而且，其曝光时间可以随意调节，以获得最佳曝光效果；实验结束，膜经洗脱后可以反复使用多次，这也是其优点。

11．探针的同位素标记方法有多种，其中缺口平移法与随机引物法最为常用。采用缺口平移法标记同位素时，使用的标记物应在脱氧核三磷酸的α-磷酸位上；所使用的DNase I 浓度一定要适当，过高则导致缺口过多，从而使探针长度过短，过低则不足以形成足量的缺口，从而使标记效率下降；反应温度一定要控制在14～16℃之间；另外，单链DNA和RNA不能采用此方法进行标记。随机引物法除能进行双链DNA标记外，也可用于单链DNA和RNA探针的标记。此法操作方便，标记活性高，因而为多数实验室所采纳。目前已经有许多种探针标记的试剂盒，可以方便的择用。

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