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Adaptation des Alvinellidés aux conditions de stress

UMR 7144- CNRS - UPMC Equipe Ecophysiologie. Adaptation des Alvinellidés aux conditions de stress oxydatif de l’environnement hydrothermal profond. Approche protéomique. Jean Mary Maître de conférences Univ. Paris 7 – Denis Diderot Délégation CNRS. Journée Stress oxydant, 28 juin 2007.

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  1. UMR 7144- CNRS - UPMC Equipe Ecophysiologie Adaptation des Alvinellidés aux conditions de stress oxydatif de l’environnement hydrothermal profond. Approche protéomique Jean Mary Maître de conférences Univ. Paris 7 – Denis Diderot Délégation CNRS Journée Stress oxydant, 28 juin 2007

  2. Les sources hydrothermales profondes: un milieu extrême Température Pression Métaux lourds pH acide [H2S] …. Jean MARY Journée Stress oxydant, 28 juin 2007

  3. Les sources hydrothermales profondes: un milieu extrême Houdez & Lallier (2007) Réactions d’oxydation d’H2S par O2HS- + O2→ HS● + O2●- HS● + O2 → S + HO2- HO2- + H+ → H2O2 Réaction de Fenton H2O2 + Fe2+→ ●OH + Fe3+ + -OH  Stress oxydatif exogène intense, principalement (?) au niveau des branchies (tissu d’échange) Jean MARY Journée Stress oxydant, 28 juin 2007 D’après Chen et al. 1972

  4. O. Dugornay, Ifremer Ifremer Alvinella pompejana, l’eucaryote le plus thermotolérant de la planète (?) Les organismes se distribuent sur les flancs des cheminées en fonction de leur tolérance au fluide hydrothermal. Ifremer Alvinella pompejana occupe le pôle le plus chaud et résisterait à des températures de 80°C (?) Alvinella pompejana (Desbruyères & Laubier 1980) Jean MARY Journée Stress oxydant, 28 juin 2007 D’après http//amex.snv.jussieu.fr/fichiers/htm

  5. Quelles sont les, les cibles du stress oxydatif, les protéines mises en œuvre par A. pompejana en réponse au stress oxydatif? • Approche protéomique différentielle Electrophorèse 2D et identification des protéines par spectrométrie de masse (SM). Définition de la distribution tissulaire des protéines cibles. Echantillons: Campagne BIOSPEEDO (dorsale sud EPR, entre 7°S et 23°S, 2004, D. Jollivet) Individus collectés soumis à expérimentation en enceinte pressurisée Deseares avec régulation chimique (DEep-SEA RESpirometer) Alvinella pompejana conditionnés 7 et 14h à différentes concentrations d’O2 (normoxie 2.3 mg d’O2/l soit ~130µM, Hypoxie 0.35 mg/l soit ~20µM, Hyperoxie 6.5 mg/l soit ~360µM) Différentes concentrations de Peroxyde d’hydrogène. Jean MARY Journée Stress oxydant, 28 juin 2007

  6. 3 banques « complètes »: - Animal entier  25 000 seq. 19 700 seq. (73% redondance) - Branchies  26 500 seq. 18 100 seq. (79% redondance) - Tissu ventral  16 400 seq. 12 800 seq. (78% redondance) 1 banque en cours: - Pygidium  8 800 seq. 5 800 seq. (53% redondance) Banque de cDNA d’Alvinellapompejana Séquençage: Génoscope – Evry Annotation : IGBMC – Strasbourg (O. Poch, O. Lecompte) http://www-alvinella.u-strasbg.fr/Alvinella/ Jean MARY Journée Stress oxydant, 28 juin 2007

  7. Enzymes rédox présentes chez Alvinella pompejana O2 + 2 H2O Catalase 2e- 2e- (+4H+) 2e- 2e- (+ 2H+) 2O2 2 O2●- 2 H2O2 2 ●OH (+2 -OH) 2 H2O 2 GSH SOD (Mn ou Cu/Zn) 2H+ Glutathion peroxydases H2O2 + O2 GSSG 2R’SH 2H2O + O2 Peroxyredoxines Thioredoxine Glutathion réductase Protéasome 20S Méthionine sulfoxyde réductase A et B R’SSR’ 2 H2O Jean MARY Journée Stress oxydant, 28 juin 2007

  8. Protéomique « Canal historique » Electrophorèse 2D pH 1- Lavage 2- Digestion 3- Extraction Analyse par SM (MALDI-TOF LC-MS/MS) PM Quelle(s) est (sont) la (les) protéine(s) dans ce spot? Identification de la protéine 1- Hsp70 2- Kératine... 3- Trypsine... Traitement informatique des données (banque de cDNA) Jean MARY Journée Stress oxydant, 28 juin 2007

  9. Analyse par E2D des protéines solubles de branchies Branchies réduites en poudre dans N2 liquide, précipitation des protéines au TCA / Acétone 10% (v/v) / b mercaptoéthanol 0.07% (v/v) Reprise des protéines dans tampon d’extraction 500µg déposés, coloration bleu colloïdal 132 78 45.7 32.5 18.4 kDa pH 3 pH 10 pH 4 pH 7 Jean MARY Journée Stress oxydant, 28 juin 2007

  10. Conditions normoxie vs. hypoxie Hypoxie 0.35 mg O2/l Normoxie 2.30 mg O2/l 78 45.7 32.5 18.4 kDa pH 4 pH7 pH7 pH 4 Branchies, échantillon 1581-1 (normoxie) et 1584-140 (hypoxie) Site Garrett-17S. Jean MARY Journée Stress oxydant, 28 juin 2007

  11. Conditions normoxie vs. hypoxie Normoxie 2.30 mg O2/l Hypoxie 0.35 mg O2/l Spot acide (oxydation cystéine?) 18.4 kDa 18.4 kDa Branchies, échantillon 1581-1 (normoxie) et 1584-140 (hypoxie) Site Garrett-17S. Jean MARY Jean MARY Journée Stress oxydant, 28 juin 2007 Journée Stress oxydant, 28 juin 2007

  12. Perspectives • Comparer quantitativement les états normoxie, hypoxie et hyperoxie • (2D DIGE), • Doser les activités des principales enzymes rédox (SOD, Gpx et Prdx) • dans les branchies, • - Effets de H2S sur l’activité enzymatique de ces enzymes, • Quid des Msr? Jean MARY Journée Stress oxydant, 28 juin 2007

  13. Systèmes antioxydants (SOD, catalase, GPx, Prx) Réparation • Trx, GSH, Srx1 • Msr • Dégradation • Protéasome • Lon protéase Production des ROS (O2•-,OH•,H2O2…) ROS ROS ADN Lipides ROS e- Protéines (méthionine, cystéine)

  14. Oxydation et réduction des résidus méthionines L-Méthionine CH3  S  CH2  CH2  3 HN C  H  -OCO MsrA MsrB Trx/TrxR/NADPH Trx/TrxR/NADPH CH3 O= S CH2  CH2  3HN  C  H  -OCO H2O2 H2O2 - - - - - + L-Méthionine, S-sulfoxyde L-Méthionine, R-sulfoxyde  CH3 S = O CH2  CH2  3HN  C  H  -OCO CH3  O = S = O  CH2  CH2  3HN  C  H  -OCO - - - - - + H2O  + H2O H2O2 H2O2 + H2O + + + L-Méthionine sulfone

  15. Enzymes de la réponse au stress oxydatif Superoxide dismutase [EC 1.15.1.1] 2 O2•- + 2 H+→ O2 + H2O2

  16. Peroxyrédoxines [EC 1.11.1.15] 2 R'-SH + ROOH → R'-S-S-R' + H2O + ROH

  17. Glutathion peroxydase séléno-dépendante [EC 1.11.1.9] 2 glutathione + H2O2 → glutathione disulfide + 2 H2O

  18. Thioredoxine

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