Interferencja RNA (RNAi, RNA interference)

1. Interferencja RNA (RNAi, RNA interference)

2. Nobel 2006 Andrew Fire i Craig C. Mello

3. RNAi historia • 1998 – wprowadzenie dsRNA do nicienia C. elegans wycisza ekspresję genu o sekwencji komplementarnej → interferencja RNA (Craig, Mello) • pierwsze wskazówki jednak już w latach 1990: próba wprowadzenia dodatkowego genu syntazychalonowej daje efekt odwrotny – poziom mRNA dla syntazy spada • Konserwatywny mechanizm w świecie zwierząt i roślin spełniający funkcje: • Obrona przed infekcjami wirusowymi • Obrona przed transpozonami • Regulacja metylacji DNA w obrębie promotora Matzke MA, Matzke AJM (2004) Planting the Seeds of a New Paradigm. PLoS Biol 2(5): e133

4. Wprowadzenie do tytoniu dwóch osobnych transgenów wykorzystujących taki sam promotor Pierwszy transgen jest aktywny o ile nie jest w komórce obecny drugi transgen → metylacja DNA promotora wyciszanego transgenu w obecności drugiego zawierającego sekw. homologiczne CH3 x promotor Gen 1 • Wyciszenie i metylacja zanikają w kolejnych komórkach potomnych na skutek odseparowania dwóch transgenów • Interakcja wspólnych promotorów indukuje transkrypcyjne wyciszanie ekspresji genów -TGS (transcriptional gene silencing) promotor Gen 2

5. siRNA (ang. short interfering RNA) – krótka dwuniciowa cząsteczka RNA (21-23 nt) o sekwencji homologicznej do fragmentu docelowego mRNA

6. DICER końce 3’ mają 2nt niesparowane Uwaga: wprowadzanie dsRNA do komórek kręgowców indukuje odpowiedź interferonową

7. DICER – enzym typu RNAza III • Zawiera domeny: • Domena o właściwościach helikazy i hydrolazy fosfodwuestrowej; • RBD (RNA Bindingdomain) – wiążąca RNA • dsRBD (dsRNABindingdomain) – wiążąca dsRNA • PAZ (Piwi, Argonaute, Zwille/Pinhead); • działa w postaci dimerycznej • → produkty działania enzymu DICER mają niesparowane 2 nukleotydy na końcu 3’ i grupę fosforanową na końcu 5’ (inne produkty słabiej indukują interferencję)

8. RISC (RNA-inducedsilencingcomplex) jest złożony: • 1. Białka z rodziny Argonaute posiadają 3 domeny: • PAZ – wiązanie końca 3’ siRNA • Mid - wiązanie końca 5’ siRNA • PIWI – aktywność endonukleazy (pokrewna RNAzy H) • Ago1 – odpowiedzialny za represję, Ago2– za właściwości endonukleazy • do kompleksu RISC wchodzą jeszcze inne białka o nieznanej dotąd funkcji (VIG, Tudor-SN, Fragile-X, Dmp68, Gemin3) • RISC jest częścią struktury cytoplazmatycznej zwanej ciałkami P (P-bodies)

9. Degradacja mRNA przez kompleks RISC: • w kompleksie RISC dochodzi do degradacji nici sensownej, pozostaje antysensowna (wiodąca); wybór nici jest uzależniony od stabilności termodynamicznej końców siRNA – nić posiadająca mniejszą stabilność na końcu 5’ pozostaje w RISC (etap katalizowany przez DICER) • w rejonie „seed” zlokalizowanym pomiędzy 2 i 8 nukleotydem od końca 5’ następuje rozpoznanie i wiązanie z docelowym mRNA • antysensowna nić hybrydyzuje z komplementarnym mRNA tworząc krótki fragment dwuniciowy • przecięcie mRNA w pojedynczym miejscu oddalonym pomiędzy 11-12nt od końca 3’ siRNA (Ago2) • dalsza degradacja mRNA przez niespecyficzne egzonukleazy mRNA siRNA

10. w przypadku niepełnej komplementarności sekwencji siRNA do mRNA zachodzi inhibicja translacji • Mechanizmy odpowiedzialne za ogólną degradację mRNA: • przed degradacją zachodzi proces deadenylacji końca 3’ poli(A), po której następuje działanie egzonukleolityczne 3’ – 5’ przez egzosom • dekapowanie przez Dcp1/Dcp2, po którym degradacja przy udziale egzonukleaz 5’ - 3’

11. Zjawisko przechodzącego wyciszania (transitive silencing) GFP siRNA białko fuzyjne UNC-22 i GFP przejście wyciszenia w kierunku od 3’ do 5’ wyciszenie UNC-22 i GFP wyciszenie GFP Gregory J. HannonRNA interference, Nature (2002) 418, 244-251

12. Mechanizm przechodzącego wyciszania pierwotne siRNA polimeraza RNA zależna od RNA RdRP (RNA-dependent RNA polymerase) dsRNA wtórne siRNA Brodersen and Voinnet The diversity of RNA silencing pathways in plants TRENDS in Genetics (2006) 22, 268-280

13. Metody wytwarzania siRNA: • synteza chemiczna (siRNA) • transkrypcja in vitro (esiRNA) • wektory ekspresyjne siRNA (shRNA jako pośredni etap) • ekspresyjne kasety PCR Kryteria projektowania cząsteczek siRNA: • Znajdź sekwencję 21nt która zaczyna się od AA (siRNA posiadające jednoniciowe odcinki UU działają najefektywniej); jeśli się nie da – należy wybrać sekwencję NA lub inną ale unikać jednoniciowych odcinków GG w siRNA • Zaprojektuj 2-4 sekwencje w różnych rejonach ale 50-100nt poniżej AUG (w obrębie 5’ UTR lub 3’ UTR mRNA może być związane z białkami oraz posiadać złożoną strukturę) – jedna na dwie daje 50% hamowanie a jedna na cztery – 75-95% • zawartość GC – 30-70% (optymalnie 50%) • unikać ciągu (G)3 gdyż mogą się tworzyć agregaty cząsteczek siRNA • koniec 5’ nici antysensownej ma mieć mniejszą stabliność termodynamiczną • Sprawdź komplementarność do innych genów