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Introdução:

Introdução:. Aproximadamente um terço da população mundial está infectada por M. tuberculosis . 9 milhões de novos casos por ano. 1,8 milhões de mortes por ano. Introdução:. Por que a procura de antígenos novos são importantes? Produção de reagentes para diagnóstico e novas vacinas. PPD.

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Presentation Transcript

  1. Introdução: • Aproximadamente um terço da população mundial está infectada por M. tuberculosis. • 9 milhões de novos casos por ano. • 1,8 milhões de mortes por ano.

  2. Introdução: • Por que a procura de antígenos novos são importantes? • Produção de reagentes para diagnóstico e novas vacinas. PPD

  3. Introdução: • O genoma do M. tuberculosispossui 16 regiões do genoma deletadas em outras Mycobactérias(utilizadas para BCG, por exemplo)

  4. Introdução: • O que se tinha? • Overlaping (peptídeos sintéticos) • In vitro (ativação de linfócitos T) • Rv3874 • Rv3875 • Rv3619c • Proteína inteira • In vivo O que foi feito:

  5. Clonagem: • Amplificação: PCR • DNA M. tuberculosis • Iniciadores • dNTPs • Enzima + Tampão Purificação Ligação

  6. Ligação: vetor de clonagem univeral Transformação: Choque térmico

  7. Outras técnicas de transformação: • Genegun • Eletroporação • Vírus

  8. Seleção das culturas: Ampicilina Outras técnicas de seleção: • Bioluminescência • Azul/branco

  9. Restrição enzimática: BamHI e Hind III Ligação no vetor de expressão:

  10. Inseriram a sequencia para cauda de histidina no pGEX Vantagem: duplo sistema de purificação

  11. Expressão: • Transformação: Choque térmico • Seleção das colônias • Sequenciamento IPTG

  12. Purificação: • Resina, para retirar a GST • + • Coluna de Ni, para retirar a cauda de Histidina

  13. Purificação:

  14. Western Blotting: Anticorpo: anti- GST Anticorpo: anti- His

  15. Imunização: • Rv3874 • Rv3875 • Rv3619c + • Adjuvante de Freud • 2 apresentações com 2 semanas de intervalo • Após 2 semanas retira-se o soro

  16. Elisa:

  17. Resposta Imune celular: Linfócito B

  18. Epítopos lineares: ABCPredPredition server Proteínas também geraram epítopos lineares, assim como os peptídeos, na imunização

  19. Conclusões: • O vetor construído e a dupla purificação são eficientes • As proteínas são imunogênicas nos coelhos Questionamento: Qual a vantagem da produção da proteína recombinante para a resposta imune em coelhos?

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