Le cellule del sistema immunitario con funzioni di riconoscimento

1. Le cellule del sistema immunitario con funzioni di riconoscimento

2. STRUTTURA DELLE Ig

4. L’IMPORTANZA DELLA REGIONE CERNIERA

5. Digestione parziale con enzimi proteolitici

6. La scoperta che individui affetti da mieloma multiplo (tumore derivato da una plasmacellula) producono in grande quantità Ig con un’unica specificità antigenica, ha reso possibile il sequenziamento delle catene leggere (L) e pesanti (H)delle Ig Il confronto delle sequenze ottenute da pazienti diversi ha rilevato, sia nelle catene L che nelle H, la presenza di una porzione Variabile (ca. 110 aa) e di una porzione costante (ca. 110 aa nelle catene L e 330 o 440 aa nelle catene H)

7. LE TRE REGIONI IPERVARIABILI (CDR) DEL DOMINIO VARIABILE Variabilità = n° di differenti aa in una certa posizione / freq. dell’aa più comune in quella posizione CDR = Complementarity Determining Region Le CDRs delle catene L ed H vengono a trovarsi spazialmente vicine nella struttura quaternaria  sito di legame per l’Ag

8. Sulla base della sequenza aminoacidica le catene pesanti possono essere suddivise in 5 differenti classi (e alcune classi possono essere suddivise in sottoclassi) che vengono indicate con lettere dell’alfabeto greco (a, d, e, g, m) Le catene leggere possono essere suddivise in 2 differenti tipi (k e l) e le k in sottotipi

9. Le catene pesantig, deahanno 3 domini C Le catene pesantimeehanno 4 domini C

10. LE CINQUE CLASSI DI Ig

13. Le Ig vengono prodotte come proteine secrete o di membrana

14. Differenze isotipiche Individui della stessa specie presentano tutti gli stessi isotipi. Il numero di diversi isotipi varia da specie a specie Differenze allotipiche Si riscontrano tra individui della stessa specie Differenze idiotipiche Si riscontrano tra linfociti B dello stesso individuo

15. La struttura delle Ig presenta alcune caratteristiche difficili da conciliare con i modelli genetici classici dell’epoca in cui la loro struttura è stata in gran parte chiarita • Enorme diversità (= grande repertorio, dell’ordine di 108) in ciascun individuo • Presenza nella stessa molecola di una regione variabile (sostanzialmente unica, cioè presente solo in quel clone cellulare) e di una regione costante • Esistenza di Ig di classi diverse ma con la stessa specificità antigenica

16. 1965 - Dreyer e Bennett ipotizzano che sia le catene pesanti che le leggere siano codificate da due segmenti genici distinti che in qualche modo ad un certo stadio dello sviluppo dei linfociti riarrangiano e formano un unico gene che viene trascritto e tradotto (viene contraddetto il dogma un gene  una catena polipeptidica). Essi inoltre ipotizzano l’esistenza di molti (centinaia o migliaia) segmenti V e di pochi segmenti C.

17. Solo nel 1976 si è avuta la prova definitiva della sostanziale esattezza di questa ipotesi Tonegawa e Hozumi  confronto tra i DNA estratti da cellule di mieloma e da cellule embrionali digeriti con RE e ibridati con Ig-mRNA  nelle prime si ha ibridazione con un solo frammento, nelle seconde con due

18. Dimostrazione sperimentale dell’esattezza dell’ipotesi ‘due geni  una catena polipeptidica’ formulata da Dreyer e Bennett nel 1965

19. Organizzazione dei cluster genici delle catene leggere e delle catene pesanti delle Immunoglobuline nell’uomo

20. Riarrangiamenti (V-J) a livello di DNA portano alla formazione di un gene funzionante

21. Catene pesanti: ricombinazione V-D-J

22. La regione Variabile è codificata dai segmenti genici riarrangiati: V e J nelle catene leggere e V, D e J nelle catene pesanti

23. Il riarrangiamento avvicina sequenze Promotrici e sequenze Enhancer

24. Il linfocita B maturo che non ha ancora incontrato l’Ag esprime mIgM e mIgD Splicing alternativo

25. In ciascun linfocita B viene espresso un solo allele per le catene pesanti ed un solo allele per le catene leggere (esclusione allelica)

26. MATURAZIONE DEI LINFOCITI B • Riarrangiamento dei segmenti genici della catena pesante  produzione di catene m (e d) da un solo allele • Riarrangiamento dei segmenti genici della catena leggera k produzione di una IgM (e IgD) completa (con catene k prodotte da un solo allele) • Se lo step 2. non è stato produttivo, si ha riarrangiamento dei segmenti genici della catena l  produzione di una IgM completa (con catene l prodotte da un unico allele) Se non si arriva alla formazione di un gene VH E di un gene VL funzionanti il pre-linfocita non sarà in grado di produrre alcuna Ig e morirà per apoptosi

27. Il riarrangiamento produttivo del 1° allele blocca il riarrangiamento del 2° allele – Se nessuno dei due alleli effettua un riarrangiamento produttivo il linfocita muore per apoptosi

28. COME AVVIENE LA RICOMBINAZIONE DEI VARI SEGMENTI GENICI ? Sono necessarie sequenze segnale che fiancheggiano le regioni che devono essere unite e sistemi enzimatici (sia ubiquitari che linfocita-specifici)

29. STRUTTURA DELLE SEQUENZE SEGNALE (RSS = Recombination Signal Sequence)

30. Riconoscimento delle RSS da parte di RAG-1 e RAG-2 (complesso enzimatico linfocita-specifico) e sinapsi delle RSS  i due segmenti genici vengono avvicinati • Taglio di un singolo filamento di DNA • Taglio del secondo filamento e legame ‘a forcina’ delle estremità tagliate • Taglio casuale delle forcine • Riunione delle estremità catalizzata dal complesso enzimatico DSBR (Double Strand Break Repair)

31. I punti di giunzione possono variare. Questa flessibilità giunzionale può dare origine a riarrangiamenti non produttivi Si stima che solo nel 10% dei pre-linfociti si verifichino riarrangiamenti produttivi per le catene L e per le H

33. Un’ulteriore fonte di variabilità deriva dal taglio casuale delle forcine e dall’aggiunta di nucleotidi nel sito di riunione

35. Aggiunta di nucleotidi P e N

36. Origine della variazione nelle tre CDR

37. Grandezza del repertorio anticorpale generato dall’unione combinatoriale dei diversi tipi di segmenti

38. Ig dello stesso isotipo e con uguale regione V vengono prodotte sia come proteine di membrana che secrete attraverso un meccanismo di splicing alternativo

39. Eventi di splicing alternativo producono anche Ig con la stessa regione variabile ma diversa regione costante

40. Il legame con l’Ag induce ulteriori cambiamenti  produzione di Ig secrete, switch isotipico, ipermutazione somatica (in seguito alla quale verrà prodotto un Ab che ha con l’Ag una aumentata affinità di legame)

41. TCR = T Cell Receptor Proteina di membrana dei linfociti T, scoperta e caratterizzata all’inizio degli anni ‘80

42. TCR = T Cell Receptor

43. Cluster dei geni per il TCR

44. La ricombinazione dei segmenti genici del TCR

45. I cluster genici del TCR nell’uomo

47. I meccanismi di generazione della diversità nelle Ig e nei TCR

48. Linfociti B (e T) diversi esprimono Ig (e TCR) diversi perché HANNO geni diversi (generati dalla ricombinazione somatica) e non perché ESPRIMONO geni diversi di genomi uguali