Fisiopatologia del Sistema Immunitario

1. Fisiopatologia del Sistema Immunitario Modulo di Biochimica Tiziana Alberiotiziana.alberio@uninsubria.itc/o Lab. di Biochimica e Proteomica Funzionale, 1° piano • 1 e 2 – Le molecole del sistema immunitario: Ig, MHC, TCR • 3 – Il Complemento • 4 – Citochine e Recettori

2. Le molecole del Sistema Immunitario 1- Struttura delle Immunoglobuline

3. Nucleo strutturale simmetrico: 2 catene leggere 24 kDa 2 catene pesanti 55 o 70 kDa Regioni variabili Riconoscimento dell’antigene Ponti disolfuro Catena leggera Regioni costante funzione effettrice Catena pesante

4. Catene leggere (L) e pesanti (H) CL VL hinge CH1 VH CH2 • La struttura della molecola è garantita da: • Interazioni non covalenti tra domini Ig • Ponti disolfuro tra L e H e tra le regioni C di H (cerniera) CH3

5. Struttura generale di un anticorpo Riconoscimento dell’antigene e funzioni effettrici: funzioni spazialmente separate e indipendenti

6. Esperimenti di clivaggio proteolitico cerniera: zona più suscettibile all’attacco proteolitico (tra Cγ1 e Cγ2) La proteolisi con papaina genera: Fabantigen-binding, mantiene la capacità di legare l’Ag Fc, frammento cristallizzabile La proteolisi con pepsina interessa la regione C-term della cerniera e genera: Fab’ (Fab+cerniera) F(ab’)2 se vengono mantenuti S-S Fab e F(ab’)2 utili sperimentalmente: legano l’Ag ma non hanno funzione effettrice

7. Il dominio immunoglobulinico • ≈ 110 a.a. che ripiegano in maniera indipendente • 2 strati di foglietto β planare (β sandwich) • ciascuno composto da 3-5 β-strands (5-10 a.a.) antiparalleli motivo a chiave greca • Stabilizzato da: • ponti disolfuro • interazioni idrofobiche tra i due foglietti β • Conservazione di specifici residui (es. Cys e Trp)

8. La superfamiglia delle immunoglobuline Ab • tutte le molecole che contengono il dominio Ig; mediano funzioni di riconoscimento, adesione e legame • omologia di sequenza • tutti i geni che codificano per domini Ig si sono evoluti da un gene ancestore comune • Evento precoce: duplicazione genica, con divergenza esoni V e C. Evoluzione: 1) Divergenza “V e C” e TCR (sequenza). 2- Capacità di riarrangiare il DNA (per riconoscimento Ag) • La funzione dipende dall’interazione tra domini Ig MHC TCR

9. C e V in catene leggere (L) e pesanti (H) V= N-term C= C-term H: V → 1 dominio C → 3 o 4 domini L: V → 1 dominio C → 1 dominio V: la sequenza a.a. differenzia gli Ab prodotti da un clone di linfociti B

10. Segmenti ipervariabili o CDR Complementarity Determining Region: ≈ 10 a.a. CDR3 il più variabile N-term C-term

11. Regioni ipervariabili o CDR Le CDR formano delle anse esposte sulla superficie, strutture chimiche uniche → SPECIFICITA’ Sequenze conservate adiacenti → ripiegamenti del dominio Ig

12. Cause della diversificazione Organizzazione genomica nei geni delle catene leggere e pesanti nell’uomo 1) Ricombinazione somatica del DNA: diversità combinatoria Diversi esoni per i diversi domini H L H

13. Cause della diversificazione 2) Diversità giunzionale V J Rottura del DNA TdT inserisce nucleotidi J V OH J Elisione di nucleotidi (nucleasi) V GTCAATG Ligazione V J GTCAATG + Introne 3) Inserzione della regione N

14. Classi o isotipi delle Ig • 5 classi, che si differenziano per la regione C della catena pesante: • IgM  Catena m • IgD  Catena d • IgG  Catena g • IgA  Catena a • IgE  Catena e 4C • uguale sequenza a.a. all’interno della stessa classe o sottoclasse 3C 3C 3C 4C • IgG1  Catena g1 • IgG2  Catena g2 • IgG3 Catenag3 • IgG4 Catenag4 • IgA1  Catena a1 • IgA2  Catena a2 Sottoclassi • Diverse funzioni EFFETTRICI

15. Classi delle Ig

16. Funzioni Effettrici Porzione Fc 1- viene riconosciuta da specifici R 2-può attivare il complemento 3- permette il trasporto attivo dell’Ab (latte, secrezioni, circolo fetale...)

17. IgM e IgA formano polimeri • IgM e IgA possono formare multimeri • Le IgM formano pentameri nel plasma • Le IgA formano dimeri nelle secrezioni mucose (necessario per il trasporto attraverso gli epiteli) • Contengono una coda C-term di 18 a.a. con un residuo Cys necessario alla polimerizzazione • Un polipeptide aggiuntivo (J: joining) di 15 kDa favorisce la polimerizzazione legando la Cys

18. Lo switch isotipico • Nel corso delle risposte umorali, il clone di linfociti B stimolato dall’Ag può produrre anticorpi di isotipo diverso (switch isotipico): • CH cambia • V, e quindi la specificità, no • VDJ riarrangiato si collega ad un gene C più a valle e il DNA frapposto viene eliminato • Regioni di scambio, 5’ di ciascun locus CH con sequenze ripetute altemente conservate

19. Lo switch isotipico • Linfocita B maturo: contemporanea espressione sulla membrana di IgM e IgD, mediante splicing alternativo e poliadenilazione selettiva • Occupazione di CD40 • Citochine • Linfocita B attivato: a seconda dello stimolo potrà produrre IgE, IgA o IgG

20. Classi o isotipi delle Ig • 2 classi (o isotipi), che si differenziano per la regione C-term della catena leggera: • κ • λ • Ogni molecola anticorpale possiede o 2κ o 2λ • Cκ e Cλ sono omologhe tra loro e omologhe a Vκ e a Vλ • Non sono note differenze funzionali • 60% κ e 40% λ nell’uomo

21. Sito di legame per l’antigene Ag VL+ VH 2 per ogni molecola di anticorpo VL VH Ab

22. Legame all’antigene • La flessibilità degli anticorpi (grazie alla regione CERNIERA) permette il legame a porzioni di antigeni multivalenti distanti • Cerniera: ≈ 10/60+ a.a. • La sequenza assume una conformazione casuale; la molecola fa una torsione tra CH1 E CH2 • La flessibilità è influenzata anche dalla capacità di VH di ruotare attorno a CH1

23. Legame all’antigene • Legame reversibile e non covalente • Il contributo di ciascuna forza dipende dalla struttura del sito di legame e da quella del determinante antigenico AFFINITA’: • forza di legame tra un singolo sito combinatorio e un epitopo antigenico. Si esprime come costante di dissociazione (Kd). Tra 10-7 e 10-11 M. AVIDITA’: • forza di legame complessiva tra Ag e Ab (aumento geometrico) (rilevante per IgM)

24. L’Ab come Ag • isotipi: Riconosciute da Ab anti-isotipo le immunoglobuline dello stesso isotipo di una specie • allotipi: L’Ab riconosce in modo specifico solo alcune Ig dello stesso isotipo della stessa specie. Le differenze sono dovuti a diversi alleli per la regione C (polimorfismi) • idiotipi: L’Ab riconosce in modo specifico la regione V dell’Ig