Anticuerpos irregulares clínicamente significativos y su detección pre transfusional

1. Anticuerpos irregulares clínicamente significativos y su detección pre transfusional DraFabiana Bastos División Inmunohematología Departamento de Hemoterapia e Inmunohematología Hospital de Clínicas “José de San Martín” Universidad de Buenos Aires cbastos@fmed.uba.ar

2. ANTICUERPOSc • REGULARES o ESPERADOS = • IRREGULARES o INESPERADOS

3. ANTICUERPOS • IRREGULARES o INESPERADOS • Aloanticuerpos INMUNES: en respuesta al estímulo con glóbulos rojos • Transfusión • Embarazo • Trasplante

4. ANTICUERPOS • IRREGULARES o INESPERADOS • Aloanticuerpos ocurrencia NATURAL: en respuesta a estímulos ambientales • Polen • Hongos • Bacterias

5. ORIGEN DE ANTICUERPOS INMUNES

6. Detección de anticuerpos irregulares • Juega un papel fundamental en la medicina Transfusional • Es un proceso clave en las pruebas de compatibilidad pre-transfusión • El objetivo de los métodos de detección es el hallazgo de los anticuerpos irregulares o inesperados • Presentes en 0.2 - 2 % de la población general

7. ANTICUEPOS CLINICAMENTE SIGNIFICAIVOS • Capaces de iniciar la destrucción acelerada de los glóbulos rojos portadores del antígeno • ISBT >300 antígenos 30 sistemas de grupo sanguíneo • Especificidades asociadas con: • EHFN • RHPT • Acortamiento de la sobrevida de los GR transfundidos • AHAI

8. Destrucción de GR alogénicos transfundidos Reacción hemolítica postransfusional Destrucción de GR autólogos Anemia Hemolítica Autoinmune Destrucción de GR fetales Enfermedad Hemolítica Feto Neonatal Daño tejidos trasplantados Rechazo del injerto

9. RHP Intravascular • Síntomas • Fiebre • Escalofríos • Shock • Hipotensión • Hemoglobinemia • Hemoglobinuria • IRA • CID

10. RHP Intravascular • Hemólisis rápida 10 min • IgM, fija C • 10% desenlace fatal • Anticuerpos implicados: • ABO • PP1PK • Vel • Lewis • Kidd

11. RHP Extravascular • IgG (IgG1 o IgG3) • Inmediata: durante o dentro de pocas horas: • Ac serológicamente detectable • Hiperbilirrubinemia • Anticuerpo implicados: • Kidd • Rh • Duffy

12. RHP Extravascular Tardía • Pacientes previamente inmunizados • Ac presente • Serológicamente indetectable • Transfusión inicia respuesta anamnésica • 5-7 días postransfusión (2-23 días) • Fiebre,  Hto/Hb, ictericia, hemoglobinuria

13. Factores que determinan la importancia clínica • Especificidad del anticuerpo. • La concentración y la avidez de los anticuerpos. • Rango térmico • Clase y subclase de inmunoglobulina • Actividad del sistema mononuclearfagocítico. • Movilidad y densidad de sitios antigénicos en la membrana. • Volumen de glóbulos rojos administrados. • Presencia de sustancias solubles del grupo sanguíneo

14. Factores que determinan la importancia clínica • Algunas especificidades tienen un comportamiento variable • No siempre podemos distinguir entre un Ac clínicamente significativo y uno benigno • No contamos con información inequívoca del comportamiento de algunos especificidades poco comunes • A veces no podemos precisar la especificidad de un Ac determinado

15. Importancia clínica

16. Suelen producir RHPT

17. Raramente producen RHPT

18. Habitualmente producen EHFN

19. Raramente producen EHFN

20. Anticuerpos poco comunes • Conocer la etnia del paciente • Conocer la historia clínica del paciente • Conocer hallazgos serológicos previos • Conocer medios óptimos de reacción, temperatura, etc

21. Especificidades relacionadas con la etnia • En un paciente de raza blanca, los Ac contra Agde alta frecuenciase dirigen con mayorfrecuencia contra: k, Kpb, Yta, Vel, Coa y Lub. • En individuos de raza negra los fenotiposS-s-U-Js(b-) y hrsson exclusivos, y los fenotiposFy(a-b-), Le(a-b-), Cr(a-) y Lu(b-) son máscomunes

22. Especificidades relacionadas con la etnia • El fenotipo In(b-) es exclusivo de la razaasiática, y los fenotiposGy(a-), Jr(a-) y Di(a+b-) son muchomásfrecuentes • En latinoamericanos: Di(a+b-), Ge:-2,3 y Ge:-2,-3. • En el este de Europa es máscomún el fenotipoGy(a-).

25. REACTIVOS GLOBULARES • Cada frasco contiene suspensión globular (0.8-6%) de un individuo • Deben estar tipificados al menos para los antígenos • D, C, E, c, e, P1, Lea, Leb, K, k, Fya, Fyb, Jka, Jkb, M, N, S, s • Cada lote se manufactura con donantes diferentes • Cada lote se mantiene por 45 días

26. TECNICA • Colocar una gota de suspensión globular en un tubo • Colocar dos gotas de suero en estudio • Centrifugar y leer • Incubar a 37ºC 30 minutos • Centrifugar y leer • Lavar tres veces con solución fisiológica • Agregar dos gotas de suero de Coombs • Centrifugar y leer • En los negativos agregar Control Coombs

27. INTERPRETACION • ¿En que fase ocurrió la reacción? • ¿cuál es el resultado del control autólogo? • ¿Cuántas células reaccionan? • ¿Reaccionan con la misma fuerza y en la misma fase? • ¿Hay hemólisis o campo mixto? • ¿Están realmente aglutinados los GR o se debe a fenómeno de rouleaux?

28. INTERPRETACION • ¿En que fase ocurrió la reacción? • IgG reacciona mejor en fase antiglobulínica. Pueden ser aglutinantes a 37ºC. • IgM reacciona mejor a baja temperatura y es capaz de aglutinar GR suspendidos en solución fisiológica a temperatura ambiente. • Hay IgM que pueden reaccionar en SAGH debido a la fijación de complemento.

29. INTERPRETACION

30. INTERPRETACION • ¿Cuál es el resultado del control autólogo? • Se realiza enfrentando el suero del paciente con sus propios GR de la misma forma que se enfrenta a células del panel celular. • Control autólogo negativo en presencia de una detección de anticuerpos irregulares positiva indica la presencia de un Aloanticuerpo. • Control autólogo positivo indica la presencia de autoanticuerpos, anticuerpos inducidos por drogas.

31. INTERPRETACION • ¿Cuál es el resultado del control autólogo? • Si el paciente ha sido recientemente transfundido el control autólogo positivo puede deberse a la presencia de una aloanticuerpo unido a los GR transfundidos. • La evaluación de muestras con control autólogo positivo o PCD positiva resulta en un problema complejo de resolver que necesita de la experiencia del operador. • El control autólogo puede omitirse durante la DAI pero debe realizarse en la identificación.

32. INTERPRETACION • ¿Cuántas células reaccionan? ¿Reaccionan con la misma fuerza y en la misma fase? • Presencia de un único anticuerpo dirigido contra un antígeno presente en ambas células del panel: • Todas las células reaccionan en la misma fase y con la misma intensidad • Presencia de múltiples anticuerpos. • Las células reaccionan con diferente intensidad o en diferentes medios • Presencia de autoanticuerpos. • Autocontrol positivo

33. INTERPRETACION • ¿Hay hemólisis o campo mixto? • Anti-Lea, anti-Leb, anti-Vel y anti-PP1Pk producen hemólisis in vitro • Anti-Sda, Lua y Lub producen reacciones en campo mixto.

34. INTERPRETACION • ¿Están realmente aglutinados los GR o se debe a fenómeno de rouleaux? • Se observa en todas las pruebas que contengan suero del paciente (autocontrol, inversa ABO) • Pacientes con relación albúmina-globulinas alterada (por ej. mieloma múltiple) • Pacientes que recibieron expansores plasmáticos (por ej. Dextran) • No interfiere con la fase aniglobulínica de las pruebas de detección e identificación de anticuerpos irregulares

35. EFECTO DOSIS FyaFyb Fya Fya HETEROCIGOTA HOMOCIGOTA El panel “ideal” tiene G.R. con expresión homocigota para la mayor cantidad de Ags posibles. (que expresen efecto de dosis). Si el resultado fuera anti-Fya

36. I, i, Lea, Leb, P1 ¿Qué antígenos del panel celular NO expresan EFECTO DE DOSIS con sus respectivos anticuerpos?

37. LIMITACIONES • Relación suero-células • Exceso de anticuerpos • Exceso de antígenos • Puede aumentarse la relación a 4 gotas de suero para detectar anticuerpos débiles sin agregar potenciadores. • Temperatura • Tiempo de incubación • pH

38. LIMITACIONES • Tiempo de incubación • Reacciones Ag-Ac están en equilibrio dinámico • El rango de tiempo es entre 30-60 minutos para sistemas preparados en solución salina • Los medios potenciadores pueden disminuir este tiempo a 10 minutos

39. LIMITACIONES • pH • Mayoría de los anticuerpos reaccionan entre 6.8 y 7.2 • Hay ejemplos de anti-M que reaccionan mejor a 6.5

40. METODO PARA INTERPRETAR RESULTADOS DE IDENTIFICACION • Control antólogo • Exclusión • Inclusión • Tipificación GR del paciente • Calculo de error

41. METODO PARA INTERPRETAR RESULTADOS DE IDENTIFICACION • Exclusión • Excluir aquellas especificidades que no son responsables de la reactividad observada • Examinar las células con resultados negativos en todas las fases • Los antígenos presentes en las células que no reaccionaron no son el blanco del anticuerpo presente en el suero • EFECTO DE DOSIS

42. METODO PARA INTERPRETAR RESULTADOS DE IDENTIFICACION • Evaluar los resultados • Inclusión: evaluar los resultados obtenidos y comparar con la clave para cada especificidad • Tipificar GR del paciente • Debe estar ausente el antígeno hacia el cual está dirigido el/los anticuerpos. • Calculo de error

43. METODO PARA INTERPRETAR RESULTADOS DE IDENTIFICACION • Calculo de error

44. METODO PARA INTERPRETAR RESULTADOS DE IDENTIFICACION • Pensar en mas de una especificidad • La “clave”observada NO se ajusta a la de un sólo anticuerpo • Se observan reacciones de intensidad variable, que NO se explican por “efecto de dosis”. • Diferentes hematíes reaccionan en distintas fases • Al intentar confirmar la especificidad de un único Ac, se obtienen resultados inesperados.

46. METODO para interpretar los resultados • CONTROL AUTOLOGO ? • NEGATIVO ALO ANTICUERPO • EXCLUSION • Qué Ag siguen implicados luego de la exclusión • TIPIFICACION GR PACIENTE • Ag ausente en membrana del GR • INCLUSION • La clave obtenida coincide con alguna prevista en el panel? • CONFIRMAR PROBABILIDAD DE ERROR

48. METODO PARA INTERPRETAR RESULTADOS DE IDENTIFICACION • NO excluidos • c • E • Lea • NO excluidos por heterocigota • M • S

49. METODO PARA INTERPRETAR RESULTADOS DE IDENTIFICACION • Inclusión: la clave obtenida coincide con alguna especificidad del panel? • c • Tipificación GR del paciente • R1R1

50. TECNICA EN GEL